鄧玉琴，陶澤璋，孔勇剛，許　昱，陳始明，肖伯奎

(武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430060)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)已成為全球共同關注的疾病[1]。目前認為，過敏性鼻炎是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同導致的多基因、免疫性疾病[2]。遺傳和環(huán)境因素共同決定疾病的發(fā)生，但對于大多數(shù)過敏性鼻炎患者其易感因素仍不清楚，尋找過敏性鼻炎易感基因己成為國際上研究的熱點。

單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms，SNP)是人基因組最為廣泛的遺傳變異，它體現(xiàn)人群個體差異的DNA序列變化中最基本和最常見的形式，人DNA變異的90%由SNP貢獻。近年來，人們對肺表面活性物質相關蛋白在肺外組織中顯示出的強大炎癥和免疫調節(jié)功能越來越關注[3-4]，特別是發(fā)現(xiàn)其家族成員的SNP與細支氣管炎、肺結核、肺泡蛋白沉積癥、囊性纖維病呈顯著相關性。肺表面活性蛋白D(surfactant protein D，SP-D)屬于肺表面活性物質相關蛋白中的一員，人類SP-D基因位于染色體10q21～q24。目前，已鑒定人類SP-D編碼區(qū)存在3個位點SNP，即Met11Thr(rs721917)、Ala160Thr(rs2243639)和Ser270Thr(rs3088308)，其中已發(fā)現(xiàn)Met11Thr位點的SNP與結核[5]、呼吸道合胞體病毒[6]、呼吸窘迫綜合征[7]和甲型流感病毒[8]感染有關。研究顯示，SP-D的Met11Thr位點多態(tài)性可能與哮喘有關[9]。哮喘與過敏性鼻炎具有相似的遺傳學背景，SP-D的SNP是否與過敏性鼻炎有關，尚未見國內外有關研究報道。本研究收集具備相似生活環(huán)境的我國南方就診患者作為研究對象，利用焦磷酸測序技術檢測SP-D在上述3個位點的SNP，并分析3個位點不同基因型的血清總IgE和特異性IgE之間的關系，以探討SP-D的SNP與過敏性鼻炎的關聯(lián)性。

資料和方法

對象與分組

根據(jù)中華醫(yī)學會耳鼻喉科學分會武夷山會議過敏性鼻炎診斷標準[10]，選擇就診于武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科216例[113例女性，103例男性，平均年齡為(34.3±14.38)歲]過敏性鼻炎患者,所有患者均有過敏性鼻炎的典型癥狀，并經(jīng)粉塵螨、屋塵螨、艾蒿、豚草、花粉等8種過敏原皮膚點刺試驗檢測(阿羅格點刺液，德國)和6種過敏原血清特異性IgE(戶塵螨/粉塵螨、矮豚草/高葎草、霉菌、動物皮屑等)檢測，至少有1種過敏原反應試驗陽性以上(表1)，試驗結果與病史相一致。

正常對照組84名，其中40名女性，44男性，平均年齡為(43.3±11.53)歲。對照組均無過敏性鼻炎、哮喘等過敏性疾病病史，皮膚點刺試驗和過敏原血清特異性IgE檢測結果均為陰性。

表1　216例過敏性鼻炎患者過敏原檢測結果

所有研究對象均是漢族成年人群，居住在我國南方地區(qū)。通過問卷調查和當場詢問的方式詢問每例患者的病史資料，包括家族史、母孕期有無致敏及用藥史、出生時是否早產(chǎn)、生活環(huán)境、是否養(yǎng)寵物等，建立詳盡的病史資料檔案。

方法

基因組DNA提?。翰赏庵莒o脈血5ml，EDTA-K2抗凝，-20℃暫存，按基因組DNA提取試劑盒(血液DNA提取試劑盒，北京天根生物工程有限公司)操作說明提取DNA，-20℃保存。

引物設計和合成：所有寡核苷酸引物均由大連寶生物公司合成，設計引物序列見表2。

聚合酶鏈反應：聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)體積50 μl，含10×PCR反應緩沖液4 μl，25mM MgCl2、25mM dNTP各1 μl，100 μM PCR正向引物及反向引物各1 μl，Taq DNA聚合酶2U及2 μl(約200 ng)基因組DNA模板。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共循環(huán)30次，隨后72℃延伸5 min。所有過程均在ABI公司9700型PCR儀上完成。

單鏈DNA模板的制備：rs3088308的PCR反向引物為5′端生物素標記，rs721917及rs2243639的引物均為正向。在40 μl PCR擴增產(chǎn)物中加入36 μl結合緩沖液(Pyrosequencing AB公司試劑)及4 μl鏈親和素(strepta-vidin)包被的磁珠，室溫下孵育5 min，用Pyrosequencing AB公司專用單鏈純化裝置吸取吸附有PCR產(chǎn)物的瓊脂糖珠。依次用70%乙醇，變性緩沖液，清洗緩沖液各清洗15 s，然后將瓊脂糖珠轉移到預先加有45 μl退火緩沖液(含0.3uM測序引物)的pyro96孔板中。

焦磷酸測序：實時焦磷酸測序在PSQ96微測序儀進行，采用Pyrosequencing公司PSQ96 SQATM試劑盒，參照試劑盒操作說明進行。將PSQTM 96孔板中，置于80℃變性2 min，待冷卻至室溫后，將96孔板放入PSQ96測序儀樣本艙中，PSQ96-SQATM酶混合物(包括DNA Polym erase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)加入SQA反應筒中，測序反應自動進行[11-12]。測序反應圖像和數(shù)據(jù)由PSQ96 MA2.1軟件分析處理，得到SNP測定結果。

血清IgE檢測：利用人免疫球蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測血清中總IgE水平。采用敏篩過敏原定量檢測系統(tǒng)檢測患者血清中戶塵螨/粉塵螨等6種過敏原特異性IgE水平。血清特異性IgE水平>0.35 kU/L表示該過敏原陽性。

統(tǒng)計學分析

采用SHEsis在線軟件(http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析是否符合Hardy-Weinberg平衡定律和連鎖不平衡。基因型和等位基因頻率采用頻率計數(shù)法計算，基因型及組間等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗或四格表確切概率法。使用SPSS(13.0版本)軟件中方差分析(ANOVA)比較不同基因型與血清特異性IgE之間的關系，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

焦磷酸測序分析及基因型鑒定

過敏性鼻炎組和對照組SP-D 3個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(均P>0.05)。

過敏性鼻炎組rs721917位點CC基因型頻率及等位基因C的頻率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.007和0.006)。rs2243639及 rs3088308位點基因型頻率和等位基因頻率在過敏性鼻炎組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)(表3)。

表2　肺表面活性蛋白D單核苷酸多態(tài)性引物序列

*：生物素標記；F：正向引物；R：反向引物

表3　兩組肺表面活性蛋白D基因位點基因型、等位基因比較

表4　肺表面活性蛋白D單核苷酸多態(tài)性與血清總IgE及特異性IgE的關系

利用SHEsis軟件對SP-D3個位點進行兩兩LD分析，結果顯示位點rs721917與rs2243639之間D′=0.048，D′<0.7；rs2243639及rs3088308位點之間D′=0.078，D′<0.7。無統(tǒng)計學意義上的連鎖不平衡現(xiàn)象，因而未行單倍體分析。

SP-D單核苷酸多態(tài)性與血清總IgE及特異性IgE的關系

所有血清總IgE及特異性IgE值均轉化為以e為底的自然對數(shù)值(loge)進行比較。過敏性鼻炎組上述3個位點不同基因型間血清總IgE及戶塵螨/粉塵螨和霉菌特異性IgE間差異無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)(表4)。

討　　論

人類基因組SNP研究所揭示的人種、人群和個體之間DNA序列的差異以及這些差異所表現(xiàn)的意義將對疾病的診斷、治療和預防帶來革命性的變化[13]。焦磷酸測序技術正是新一代DNA序列差異分析技術之一，具體原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過熒光信號的形式實時記錄模板DNA的核苷酸序列。該技術的特點是對DNA的序列分析無須進行電泳，DNA片段無須熒光標記。

已報道的SP-D單核苷酸多態(tài)性檢測方法有多種，其中聚合酶鏈式反應和限制性片段長度多態(tài)性技術應用得最多[14-15]，這種方法結果可靠但存在許多不足，實驗過程需要酶切，延長了檢測時間；檢測過程繁瑣；不能精確確定突變位置及突變類型等。本研究焦磷酸測序在聚合酶鏈式反應擴增后，可在2 h內對結果進行自動化分析，明顯縮短了實驗時間。另外，傳統(tǒng)的測序法1周期只能做十幾個樣品，而PSQ96MA系統(tǒng)一次可完成96個樣品的分析，具有高通量的特點。因此，焦磷酸測序適用于大樣本量人群的相關基因DNA單核苷酸多態(tài)性的分析。

國外已有研究提示SP-D的SNP與過敏性哮喘及氣道炎性疾病的關系[5-9，16]，研究對象大多為居住在西方國家的人群。然而，SP-D的SNP與亞洲人群過敏性鼻炎的關系尚未見報道。為避免不同種族人群之間的基因差異和生活環(huán)境差異，本研究實驗對象均為漢族并生活在中國南方地區(qū)。在本研究中，過敏性鼻炎組rs721917位點的CC基因型頻率及等位基因C的頻率顯著高于對照組，從基因型頻率的相對風險分析發(fā)現(xiàn)，CC基因型患過敏性鼻炎的風險是TT型的2.847倍(比值比=2.847，95%可信區(qū)間為1.313～6.176)，有C等位基因者患過敏性鼻炎的危險性增加了1.633倍(比值比=1.633，95%可信區(qū)間為1.153～2.397)，提示rs721917位點等位基因C可能是中國漢族人群過敏性鼻炎的易感基因。rs2243639及rs3088308位點的基因型頻率和等位基因頻率在過敏性鼻炎組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義，說明這兩個位點在過敏性鼻炎中不起關鍵性的作用。

SP-D在抵御炎癥性細菌、病毒和抑制過敏性炎癥方面發(fā)揮著重要的作用[17]。有報道指出rs721917位點的CC基因型影響血漿SP-D水平，甚至可能影響SP-D正常的結構及功能，與TT基因型相比，CC基因型血漿中SP-D含量要低得多[18]。國外學者也發(fā)現(xiàn)SP-D該位點的CC基因型多態(tài)性增加了結核病[5]及流感病毒A感染[8]的危險性。因此，推測rs721917位點的CC基因型可能通過影響體內SP-D水平，使SP-D抑制炎癥反應的保護性功能降低，進而導致發(fā)生過敏性鼻炎的危險性增大。然而，與本研究不同的是，Krueger等[16]研究發(fā)現(xiàn)SP-D的rs721917，rs2243639及rs3088308三個位點的多態(tài)性與法國兒童哮喘發(fā)生無明顯關聯(lián)。另有研究發(fā)現(xiàn)，SP-D同一個位點的CC基因型與黑人兒童的遺傳過敏癥有相關性，但是CC基因型降低了該研究人群中發(fā)生遺傳過敏癥的機會[9]。究其原因，受試對象的遺傳學背景，種族，生活環(huán)境及不同年齡段特征存在差異，另外，本研究采用焦磷酸測序法也不同于以上兩位學者的研究，以上這些因素可能都會影響結果的不同。

研究顯示在炎性反應調節(jié)方面，與不同受體分子結合，SP-D發(fā)揮雙重調節(jié)作用。當SP-A及SP-D植物凝集素區(qū)(CRD區(qū)域)與上皮細胞或抗原遞呈細胞上的SIRP-α受體結合，可抑制炎性反應細胞產(chǎn)生促炎因子，維持抑炎性反應環(huán)境；當SP-A及SP-D膠原尾部與巨噬細胞上的鈣網(wǎng)織蛋白或CD91受體結合，可促進促炎性細胞因子的產(chǎn)生，加快對病原體的清除[19]。提示SP-D的rs721917位點SNP可能影響了SP-D膠原尾部或植物凝集素區(qū)的正常結構，促使SP-D與不同的受體結合，發(fā)生促進或抑制炎性反應作用。正是因為SP-D這種雙重調節(jié)作用，同時又從一側面解釋了為何SP-D SNP在本研究中增大了過敏性鼻炎的易感性，而在國外研究中降低了黑人兒童遺傳過敏癥的易感性。

體內血清總IgE水平與過敏性疾病的發(fā)病密切相關。IgE是Ⅰ型變態(tài)反應最主要的介質，總IgE即各種特異性IgE抗體的總和。總IgE升高并不表示一定患有變態(tài)反應性疾病，總IgE水平正常并不能排除過敏性疾病的可能，但其作為診斷參考仍具有重要參考價值。SP-D可阻止過敏原特異性IgE與肥大細胞和嗜堿細胞膜表面的Fc-RI相連接，抑制炎癥介質生成(組胺、白三烯等)[3]。另外，由于不同地區(qū)過敏原的分布具有差異性，南方地區(qū)梅雨季節(jié)較長，溫暖濕潤，利于螨類和霉菌滋生，最常見的過敏原是螨類和霉菌[20]。因而，本研究分別比較過敏性鼻炎組3個位點不同基因型對應的血清總IgE水平以及南方地區(qū)常見的過敏原螨類和霉菌血清特異性IgE值之間的差異。研究結果顯示，過敏性鼻炎患者rs721917、rs2243639及rs3088308這3個位點對應的血清總IgE水平以及特異性IgE值之間差異無明顯統(tǒng)計學意義，提示SP-D并不直接參與調控IgE的合成，其與過敏性鼻炎患者血清IgE水平的確切關系尚需進一步大樣本的實驗研究。

本研究利用焦磷酸測序方法發(fā)現(xiàn)，SP-D的rs721917位點單核苷酸多態(tài)性與我國漢族南方地區(qū)人群的過敏性鼻炎的發(fā)生有關。對于SP-D基因多態(tài)性在過敏性鼻炎發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用仍需進一步進行大樣本、多地域、多民族廣泛深入的協(xié)同研究，從而為過敏性鼻炎的篩查、基因治療和發(fā)展特異性藥物療法奠定基礎，對防治過敏性鼻炎開辟新方向提供理論依據(jù)。

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