邱杰山，胡良峰，張麗紅，李青華，沈水娟

(紹興市人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，浙江紹興 312000)

特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)是腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)中較為常見的類型，其占NS的30%～40%，居首位[1-2]。IMN預(yù)后不良，隨訪研究顯示，表現(xiàn)為NS的IMN患者5～10年后約50%發(fā)展為腎功能衰竭[3-4]。目前，診斷腎臟病病理類型的金指標是腎組織活檢病理診斷，但其作為一種有創(chuàng)性檢查，可能發(fā)生一系列并發(fā)癥。發(fā)現(xiàn)對不同病理類型腎臟病具有特異診斷價值的外周血清標記物是一項有深遠意義的有益探索。近期研究發(fā)現(xiàn)，抗M型磷脂酶A2受體抗體(M-type phospholipase A2receptor antibody，anti-PLA2R)是對IMN診斷敏感、特異的標記物[5]。目前，國內(nèi)外研究關(guān)于該抗體的測定大都采用定性或半定量方法，且文獻中使用的Western-blot法由于操作方法復(fù)雜，單次可檢測的樣本量有限等，不適于臨床實驗室推廣。此外，尚無關(guān)于中國人群血清anti-PLA2R對IMN診斷界值的研究[5-7]。本研究旨在探索通過使用在臨床檢驗中簡單可行的酶聯(lián)免疫吸附法檢測不同病理類型慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者外周血anti-PLA2R水平，分析anti-PLA2R對IMN的診斷價值及其用于診斷IMN的臨床診斷界值。

對象和方法

對象和分組

納入2012年1月至2014年6月在紹興市人民醫(yī)院住院且行腎穿刺活檢的CKD患者，診斷標準納入?yún)⒖嘉墨I[8]。根據(jù)病理類型分為4組：IMN組、狼瘡性腎炎(lupus nephropathy，LN)組、乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎(hepatitis B virus associated membranous nephropathy，HBV-GN)組及IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)組。同時選取健康體檢者做為對照組。

方法

收集所有患者血、尿標本，檢測尿白蛋白/尿肌酐比值(albumin/urine creatinine，UAlb/Cr)、24 h尿蛋白定量(24 hour urinary protein quantitative，24hPro)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血白蛋白(aubumin，Alb)及外周血anti-PLA2R。晨尿白蛋白、尿肌酐、Scr、BUN、Alb采用日立全自動生化儀檢測，ACR計算公式為尿白蛋白/尿肌酐(g/gcr)。24h尿蛋白定量測定采用芐索氯胺比濁法，外周血anti-PLA2R采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(美國TSZ公司)。

統(tǒng)計分析

表1　各組患者一般情況及血清anti-PLA2R比較

anti-PLA2R：抗M型磷脂酶A2受體抗體；IMN：特發(fā)性膜性腎??；LN：狼瘡性腎炎；HBV-GN：乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎；IgAN：IgA腎?。籗cr：血清肌酐；BUN：尿素氮；Alb：白蛋白；UAlbCr：白蛋白尿肌酐比值；24hPro：24 h尿蛋白定量；與對照組相比，*P<0.05；與LN組相比，#P<0.05

結(jié)　　果

一般情況

共納入CKD患者76例，IMN組20例，LN組20例，HBV-GN組16例，IgA腎病組20例，健康對照組8例。5組患者年齡及Scr值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IMN組患者BUN、Alb、UAlbCr及24hPro與其他類型CKD患者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

血清anti-PLA2R比較

IMN組及LN組患者血清anti-PLA2R與其他類型CKD患者及對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IMN組血清anti-PLA2R值與LN組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IMN組患者血清anti-PLA2R水平高于其他各組(表1、圖1)。

血清anti-PLA2R與UAlbCr及24hPro的相關(guān)性

對各組患者血清anti-PLA2R與UAlb/Cr及24hPro做兩因素相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，IMN組患者anti-PLA2R與UAlb/Cr的相關(guān)系數(shù)r=0.795(P<0.001)，與24hPro的相關(guān)系數(shù)r=0.531(P=0.016)，而其他3組患者血清anti-PLA2R與UAlbCr及24hPro均無明顯相關(guān)(表2)。

血清anti-PLA2R診斷IMN受試者工作特征曲線

以腎臟病理為金標準，繪制血清anti-PLA2R診斷IMN的受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC曲線)，曲線下面積為0.938，其95%可信區(qū)間為0.881～0.996。根據(jù)敏感性和特異性之和最大的方法，確定血清anti-PLA2R臨床診斷IMN的界值為19.07 μgL，診斷敏感性為95.0%，特異性為79.1%(圖2)。

圖1各組患者血清anti-PLA2R均值(95%可信區(qū)間)

FigFig1Level of serum anti-PLA2R (95% confidence interval)

anti-PLA2R：抗M型磷脂酶A2受體抗體；IMN：特發(fā)性膜性腎病；LN：狼瘡性腎炎；HBV-GN：乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎；IgAN：IgA腎病

表2　各組患者血清anti-PLA2R與UAlbCr及24hPro的相關(guān)性Table 2　Correlation analysis of serum anti-PLA2R with UAlbCr and 24hPro

表2　各組患者血清anti-PLA2R與UAlbCr及24hPro的相關(guān)性Table 2　Correlation analysis of serum anti-PLA2R with UAlbCr and 24hPro

分組UAlb∕Cr24hProrPrPIMN0795<000105310016IgAN0274024202360316LN0301025804540077HBV?GN0707011606330178

anti-PLA2R：抗M型磷脂酶A2受體抗體；IMN：特發(fā)性膜性腎??；LN：狼瘡性腎炎；HBV-GN：乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎；IgAN：IgA腎??；UAlbCr：白蛋白尿肌酐比值；24hPro：24 h尿蛋白定量

圖2血清anti-PLA2R診斷IMN的受試者工作特征曲線

FigFig2Receiver operating characteristic curve of serum anti-PLA2R in the diagnosis of IMN anti-PLA2R：抗M型磷脂酶A2受體抗體；IMN：特發(fā)性膜性腎病

討　　論

PLA2R是一個相對分子質(zhì)量為185 000的多功能M-型糖蛋白受體，屬于C型凝集素超家族中甘露醇受體家族，由一個富含半胱氨酸N端的細胞外部分、一個纖維連接蛋白樣的區(qū)域、8個C型凝集素域重復(fù)串聯(lián)序列、一個跨膜區(qū)域和一個較短的C端作為細胞內(nèi)部分而構(gòu)成[9]。其最初是從腎臟組織中克隆而獲得的，主要定位于人類腎小球足細胞膜上，其特異性地與分泌型磷脂酶A2(secretory phospholipase A2，sPLA2R)相結(jié)合而參與一系列生物學(xué)反應(yīng)[10]。

目前，醫(yī)學(xué)界在對IMN發(fā)生機制探索過程中共發(fā)現(xiàn)了三個具有里程碑意義的靶抗原。第一個是源于Heymann腎炎模型針對大鼠IMN的特異性抗原——Megalin，但人類的腎臟足細胞并不表達Megalin，故Megalin不是人類IMN的靶抗原[11]。第二個是與新生兒IMN相關(guān)的抗原——中性肽鏈內(nèi)切酶(neutral endopeptidase，NEP)，但NEP在成人腎組織中幾乎不表達[12]。第三個即是PLA2R[5]，該抗原僅與IMN患者腎組織中的anti-PLA2R抗體結(jié)合，而與正常對照組及SMN組，如乙肝相關(guān)性腎炎、狼瘡性腎炎等患者腎組織中的抗-PLA2R抗體均不發(fā)生反應(yīng)。推測可能是由于IMN患者外周血循環(huán)中的anti-PLA2R抗體與足細胞上的PLA2R相結(jié)合形成原位免疫復(fù)合物導(dǎo)致了足細胞損傷及IMN的發(fā)生及發(fā)展。研究顯示IMN患者中anti-PLA2R的檢出陽性率可達70%[12]，且人anti-PLA2R不能與鼠及兔腎組織中的PLA2R抗體相結(jié)合[5]，提示anti-PLA2R抗體不僅是特異于IMN的自身抗體，而且還具有種屬特異性。對復(fù)發(fā)的IMN患者及腎移植術(shù)后MN患者血清anti-PLA2R抗體的檢測發(fā)現(xiàn)，510的復(fù)發(fā)性IMN患者anti-PLA2R表達陽性，而腎移植術(shù)后MN患者中該抗體均表達陰性[13]。Debiec等[14]研究也有相似的結(jié)論。一項關(guān)于我國IMN與SMN患者anti-PLA2R的研究發(fā)現(xiàn)，75%～85%的IMN患者可檢測到IgG1或IgG4亞型的anti-PLA2R抗體，而在SMN患者中，30%惡性腫瘤相關(guān)性MN患者及5%的Ⅴ型LN可檢測到該抗體[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，IMN及LN組患者血清anti-PLA2R值與其他類型CKD患者及對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時IMN組血清anti-PLA2R值與LN差異有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮主要是由于本研究納入的LN患者中有6例是Ⅴ型LN，從而使LN組該抗體水平升高，這可能從另一個角度說明該抗體與足細胞病變的相關(guān)性。但5組間比較顯示IMN組患者血清anti-PLA2R的表達明顯高于LN組、HBV-GN組、IgAN組患者及健康對照組，提示血清anti-PLA2R測定有助于對IMN患者的診斷及鑒別診斷。以腎活檢腎臟病理為金標準，繪制血清anti-PLA2R診斷IMN的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)曲線下面積為0.938(0.881～0.996)，根據(jù)敏感性和特異性之和最大的方法確定血清anti-PLA2R臨床診斷IMN的界值為19.07 μgL，敏感性為95.0%，特異性為79.1%，提示血清anti-PLA2R對診斷IMN具有較高的敏感性和特異性。

有研究證實，anti-PLA2R的出現(xiàn)及其在血清中滴度變化與IMN患者病情活動成正相關(guān)，如果以蛋白尿判斷IMN患者病情活動與否作參照，anti-PLA2R抗體可作為提示病情活動的指標[16]。有歐洲學(xué)者通過Western blot法對18例經(jīng)利妥昔單抗治療的IMN患者治療前后血清anti-PLA2R進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)77.8%的IMN患者血清該抗體呈陽性表達，而且其滴度的高低與患者臨床病情活動性及蛋白尿的多少呈顯著正相關(guān)[17]。Hoxha等[18]對使用利妥昔單抗治療的5例IMN患者檢測外周血anti-PLA2R發(fā)現(xiàn)，2例蛋白尿完全或部分緩解的患者該抗體的表達轉(zhuǎn)陰，而該抗體未轉(zhuǎn)陰的患者則蛋白尿持續(xù)不能達到緩解。另有學(xué)者對使用利妥昔單抗治療的35例IMN患者進行了為期24個月的隨訪研究，治療前25例(71%)患者anti-PLA2R表達陽性，治療12個月時17例(68%)患者該抗體表達轉(zhuǎn)陰或滴度下降，隨訪結(jié)束時發(fā)現(xiàn)anti-PLA2R表達轉(zhuǎn)陰或滴度下降的患者中88%蛋白尿轉(zhuǎn)陰或得到部分緩解，而anti-PLA2R未轉(zhuǎn)陰或滴度未下降的患者中蛋白尿緩解或部分緩解率僅達33%[19]。本研究對IMN、IgAN、LN、及HBV-GN 4組患者血清anti-PLA2R與UAlbCr及24hPro做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)IMN組患者血清anti-PLA2R與UAlbCr、24hPro均成正相關(guān)，而其余3組患者均無此相關(guān)性，提示anti-PLA2R滴度變化與IMN患者蛋白尿相關(guān)，是監(jiān)測患者病情變化的指標，與上述研究結(jié)果相似。

本研究通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測IMN、IgAN、LN及HBV-GN不同病理類型CKD患者外周血anti-PLA2R水平，并對anti-PLA2R與UAlbCr、24hPro做相關(guān)性分析。發(fā)現(xiàn)IMN患者血清anti-PLA2R明顯高于其他病理類型的CKD患者及正常對照組。血清anti-PLA2R診斷IMN的敏感性為95.0%，特異性為79.1%，其診斷界值為19.07μgL。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清anti-PLA2R表達與IMN患者24hPro及UAlbCr成明顯正相關(guān)，提示血清anti-PLA2R可能是診斷及監(jiān)測IMN患者病情變化的新型血清標記物。

[1]Falk RJ，Jennette JC，Nachman PH.Primary gloerular disease，Brenner BM，ed.The kidney[M].7 th ed.Philadephia：Saunders，2004：1293-1380.

[2]Ronco P，Debiec H.Antigen identification in membranous nephropathy moves toward Targeted Monitoring and New Therapy[J].J Am Soc Nephrol，2010，21：564-569.

[3]Fervenza FC，Sethi S，Specks U.Idiopathic membranous nephropathy：Diagnosis and treatment[J].Clin J Am Soc Nephrol，2008，3：905-919.

[4]du Buf-Vereijken PW，Branten AJ，Wetzels JF.Idiopathic membranous nephroathy：outlineand rationale of a treatment strategy[J].Am J Kidney，2005，46：1012-1029.

[5]Beck LH Jr，Bonegio RG，Lambeau G，et al.M-type phospholipase A2 receptor as target antigen in idiopathic MN[J].N Engl J Med,2009，361：11-21.

[6]周廣宇，金玲，于晶，等.成人膜性腎病患者血清抗PLA2R抗體與病情的相關(guān)性[J].中華腎臟病雜志，2012，28：111-114.

[7]曹鵬龍，李士軍，鄶婷婷，等.血清抗M型磷酯酶A2受體抗體與成人特發(fā)性膜性腎病的相關(guān)性[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30：2441-2444.

[8]王海燕.腎臟病學(xué).3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：936-1531.

[9]Ronco P，Debiec H.Target antigens and nephritogenic antibodies in membranous nephropathy：of rats and men[J].Semin Immunopathol，2007，29：445-458.

[10] Chen CH，Shu KH，Wen MC，et al.Tsai FJ：Impact of plasminogen activator inhibitor-1 gene polymorphisms on primary membranous nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant 2008，23：3166.

[11] Shah P，Tramontano A，Makker SP.Intramolecular epitope spreading in Heymann nephritis[J].J Am Soc Nephrol，2007，18：3060-3066.

[12] Coenen MJ，Hofstra JM，Debiec H，et al.Phospholi- pase A2 Receptor (PLA2R1) equence Variants in Idiopathic Membranous Nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2013，24：677-683.

[13] Debiec H，Martin L，Jouanneau C，et al.Autoantibodies specific for the phospholipase A2 receptor in recurrent and denovo membranous nephropathy[J].Am J Transplant 2011，11：2144-2152.

[14] Debiec H，Guigonis V，Ronco PM，et al.Antena- talmembranous glomerulonephritis due to anti-neutral endopeptidase antibodies[J].N Engl J Med，2002，346：2053-2060.

[15] Qing WS，Laurence H，Beck Jr，et al.Anti-Phosph- olipase A2 Receptor Antibody in Membranous Nephro- pathy[J].J Am Soc Nephrol，2011，22：1137-1143.

[16] Laurence H，Beck Jr，David J，et al.Membranous nephropathy：recent travels and new roads ahead[J].Inter Society Nephrol，2010，77：765-770.

[17] Julia M，Laurence H，David M，et al.Anti-phosph- olipase A2receptor antibodies correlate with clinical status in idiopathic membranous nephropathy[J].Clin J Am Soc Nephrol，2011：1286-1291.

[18] Hoxha E，Harendza S，Zahner G，et al.An immunofluorescence test for phospholipase-A2-receptor antibodies and its clinical usefulness in patients with membranous glomerulonephritis[J].Nephrol Dial Transplant，2011，26：2526-2532.

[19] Beck LH，F(xiàn)ervenza FC，Beck DM，et al.Rituximab-induced depletion of anti-PLA2R autoantibodies predicts response in membranous nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2011：1543-1550.