周春剛， 李 卿， 湯 加， 徐 辰， 張志斌（無錫市中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214062）

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當(dāng)歸補(bǔ)血湯水提液預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞線粒體損傷保護(hù)機(jī)制研究

周春剛， 李 卿， 湯 加， 徐 辰， 張志斌*
（無錫市中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214062）

摘要：目的 探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞線粒體損傷保護(hù)機(jī)制。方法 復(fù)制缺氧/復(fù)氧大鼠H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，以始終在正常培養(yǎng)條件下的心肌細(xì)胞為正常對照組，將預(yù)先加入當(dāng)歸補(bǔ)血湯的細(xì)胞（當(dāng)歸補(bǔ)血湯組）在正常條件下培養(yǎng)24 h，與未處理細(xì)胞（模型組）同時(shí)進(jìn)行缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)，JC-1染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位，DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（IOS）水平，IT-PCI熒光相對定量檢測B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl2）、Bc12相關(guān)X蛋白（Baχ）、bc1-2/腺病毒E1B 19 000相互作用蛋白3（Bnip3）的m INA表達(dá)水平，Western b1ot檢測細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對照組比較，模型組線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)IOS水平增加明顯（P＜0.05），細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Bcl2 m INA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Baχm INA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)后，與模型組比較，線粒體膜電位下降的細(xì)胞明顯減少（P＜0.05），細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Bcl2 m INA水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后，線粒體膜電位明顯下降，細(xì)胞色素C釋放增加。當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過促進(jìn)Bcl2表達(dá)，減少IOS產(chǎn)生等機(jī)制穩(wěn)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位，減輕復(fù)氧后對線粒體功能的損傷作用。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸補(bǔ)血湯；H9c2心肌細(xì)胞；線粒體損傷；Bc12；活性氧

目前關(guān)于心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制主要有大量IOS產(chǎn)生、鈣離子超載、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞激活的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡為主的心肌不可逆損傷等［1］。細(xì)胞能量代謝障礙與心肌缺血再灌注損傷機(jī)制的多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)。線粒體作為氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的重要細(xì)胞器，線粒體功能障礙，線粒體凋亡等病理過程造成對心肌細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p害［2］。目前以線粒體為靶點(diǎn)治療心肌缺血再灌注損傷的藥理作用機(jī)制尚未完全闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠穩(wěn)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位，下調(diào)凋亡基因蛋白P53表達(dá)，有效抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［3］。對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能減輕細(xì)胞水腫和纖維化，保護(hù)心肌細(xì)胞，阻礙心肌重構(gòu)［4］。而對其他器官組織如腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元損傷及移植的內(nèi)耳干細(xì)胞等，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠減輕細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)［5-7］?？梢姰?dāng)歸補(bǔ)血湯在不同病理?xiàng)l件下對組織損傷的保護(hù)作用表現(xiàn)其多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的作用特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過建立H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯對缺氧/復(fù)氧模型細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞（H9c2），購自上海拜力生物科技有限公司（ATCC CIL1446）。

1.1.2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎劑制備 當(dāng)歸（產(chǎn)地甘肅，批號101027）；黃芪（產(chǎn)地內(nèi)蒙，批號101109）。當(dāng)歸補(bǔ)血湯（5∶1）煎劑制備采用水提醇沉法［8］，選取黃芪20.83 g、當(dāng)歸4.17 g，加5～7倍雙蒸水，煎3次，合并濾液，濃縮至較小體積，加入95%乙醇至含醇量為60%～80%，冷藏，靜置24 h后，過濾，取濾液回收乙醇，藥液濃縮備用（藥液生藥含有量為1 g/mL）。實(shí)驗(yàn)時(shí)將上述精制中藥加生理鹽水溶解，以氫氧化鈉、稀鹽酸調(diào)pH至7.2～7.4，采用DMEM高糖培養(yǎng)基定容后生藥量為50 mg/m L（原液），0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑 DMEM高糖（美國Gibco公司，11995065）；胎牛血清（美國Gibco公司，6010159）；3S柱式細(xì)胞總INA抽提試劑盒（上海博彩生物科技有限公司，K362）；JC-1染色檢測線粒體膜電位試劑盒（美國BD公司，551302）；DCFH-DA熒光探針檢測IOS試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，S0033）；SYBI PrimeScript IT-PCI KitⅡ試劑盒（日本Takara公司，I I820A）；BCA蛋白定量試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，P0010）；GAPDH單克隆抗體（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，Mab5465）；細(xì)胞色素C多克隆抗體（Bioss公司，bs-0013I）；羊抗兔二抗（美國Biowor1de公司，BS13278）。

1.1.4 儀器 流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；LightCyc1er480熒光定量PCI儀（德國Ioche公司）；二氧化碳三氣培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，Thermo 3131）；二氧化碳普通培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，Thermo 371）；SmartSpec P1us分光光度計(jì)（美國Bio-Iad公司）。

1.2 方法

1.2.1 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧模型的建立H9C2細(xì)胞株生長在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期H9c2細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶接種2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去細(xì)胞上清液，更換DMEM無糖無血清培養(yǎng)基，然后置入37℃、含94% N2﹑5% CO2﹑1% O2三氣培養(yǎng)箱中3 h，即為缺氧。棄去上清液，更換含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，置入37℃、含5% CO2的普通培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，即為復(fù)氧。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組（細(xì)胞始終在正常培養(yǎng)條件下，37℃、含5% CO2的普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）、模型組（正常培養(yǎng)條件下37℃、含5%CO2的普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后缺氧/復(fù)氧條件下培養(yǎng)）、當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理組（正常培養(yǎng)條件預(yù)先加入當(dāng)歸補(bǔ)血湯500 μg/mL，37℃、含5% CO2的普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，與模型組同時(shí)進(jìn)行缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)）。

1.2.2 JC-1染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位 當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理組和模型組細(xì)胞復(fù)氧30 min后，與正常對照組同時(shí)檢測線粒體膜電位。檢測前，配制新JC-1工作液（1∶100），樣本平均細(xì)胞數(shù)2×105個(gè)，每個(gè)樣本加入0.5 mL JC-1工作液，37℃CO2培養(yǎng)箱孵育15 min，洗滌細(xì)胞2次，每個(gè)樣本加入0.5 m L 1×緩沖液上機(jī)檢測。

1.2.3 DCFH-DA熒光探針流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)IOS水平 細(xì)胞收集后懸浮于熒光探針DCFH-DA（無血清DMEM 1∶1 000稀釋）中，終濃度為10 μmo1/L。細(xì)胞密度為1× 106個(gè)/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，用無血清DMEM洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。Iosup（50 mg/mL）作為活性氧陽性對照。

1.2.4 H9c2細(xì)胞總INA提取 采用3S柱式細(xì)胞總INA抽提試劑盒，按照試劑盒上操作步驟完成總INA的提取。在吸光度260 nm處測定INA水平，樣本INA在10～30 ng/μL，260/280 nm吸光度（D）比值范圍在1.2～1.9之間。INA提取物-80℃保存。

1.2.5 IT-PCI實(shí)時(shí)熒光相對定量 采用兩步法，管家基因β-actin作為內(nèi)參基因，目的基因Bnip3、Baχ和Bcl2及內(nèi)參基因引物序列見表1，由上海博彩生物科技有限公司合成。采用溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物的特異性。相對定量分析采用△△CT法，標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)算公式采用2-△△CT［9］。

1.2.6 Western b1ot檢測H9c2心肌細(xì)胞細(xì)胞色素C蛋白水平 細(xì)胞蛋白定量采用碧云天BCA蛋白定量試劑盒，取細(xì)胞蛋白提取液上清，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5% BSA封閉1.5 h后分別加入將膜放入雜交袋中加入一抗（1∶300稀釋），封口，室溫下孵育1 h，4℃過夜。4℃過夜孵育，用1×TBST洗膜后，以相應(yīng)的二抗孵育15 h，并以GAPDH（1∶500稀釋）單克隆抗體作為內(nèi)參對照。采用Image-Pro P1us 4.1軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值，以靶蛋白/GAPDH吸光度比值反映靶蛋白水平。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物特征

1.2.7 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異顯著性分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧損傷后流式細(xì)胞儀檢測H9c2細(xì)胞線粒體膜電位 正常培養(yǎng)條件下的對照組心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例為（11.28±3.87）%，模型組細(xì)胞在復(fù)氧30 min后，線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例為（28.89± 5.34）%，兩組比較，線粒體膜電位水平具有顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)后結(jié)果顯示，線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例為（15.85±2.76）%，與模型組比較，能夠顯著降低復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞早期凋亡率（P＜0.05），見表2。

表2 H9c2細(xì)胞線粒體膜電位（±s，n＝6）

表2 H9c2細(xì)胞線粒體膜電位（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別　　線粒體膜電位降低的細(xì)胞比例/%正常對照組11.28±3.87模型組　28.89±5.34*當(dāng)歸補(bǔ)血湯組　15.85±2.76▲

2.2 DCFH-DA熒光探針流式細(xì)胞儀檢測H9c2細(xì)胞內(nèi)IOS水平 模型組在復(fù)氧30 min后細(xì)胞內(nèi)IOS水平為（31.12±7.07）%，與正常組比較，IOS水平顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)組IOS水平為（7.36± 2.62）%，與模型組比較，IOS水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 細(xì)胞內(nèi)R0 S水平（±s，n＝6）

表3 細(xì)胞內(nèi)R0 S水平（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別　IOS水平/%正常對照組0.64±0.13模型組　31.12±7.07*當(dāng)歸補(bǔ)血湯組　7.36±2.62▲陽性對照組53.95±6.12

2.3 IT-PCI法檢測的Bcl2、Baχ、Bnip3 m INA表達(dá)水平

與正常對照組比較，模型組Bcl2 m INA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Baχm INA水平顯著升高（P＜0.05），Bnip3 m INA水平亦升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)后，與模型組比較，Bcl2 m INA表達(dá)水平顯著升高，Baχ、Bnip3 m INA水平表達(dá)水平均有降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 Bcl2、Baχ、Bnip3的mRNA表達(dá)水平（±s，n＝6）

表4 Bcl2、Baχ、Bnip3的mRNA表達(dá)水平（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

Bcl2　Baχ　Bnip3正常對照組組別1.36±0.42　 0.64±0.12　 0.66±0.24模型組　0.49±0.15*1.48±0.41*　1.19±0.41當(dāng)歸補(bǔ)血湯組　1.04±0.14▲1.12±0.12　 0.88±0.16

2.4 H9c2心肌細(xì)胞細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平 與正常對照組比較，模型組細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有顯著意義（P＜0.05）；當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)后細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平顯著降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 H9c2心肌細(xì)胞細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平（±s，n＝6）

3 討論

線粒體的結(jié)構(gòu)、功能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。正常線粒體膜電位的形成是保持線粒體功能所必需的。線粒體膜電位下降為凋亡的特征性改變。一旦線粒體膜電位損耗，細(xì)胞就會進(jìn)入不可逆的凋亡過程［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心肌細(xì)胞復(fù)氧30 min后，細(xì)胞線粒體膜電位明顯減低，細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，線粒體氧化磷酸化和細(xì)胞色素C氧化是內(nèi)源性IOS主要來源，細(xì)胞內(nèi)IOS水平顯著升高，細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，功能受損。經(jīng)過當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理心肌細(xì)胞，細(xì)胞早期凋亡率和IOS水平均明顯降低，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠提高細(xì)胞耐受氧化應(yīng)激，抑制缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。關(guān)欣等認(rèn)為當(dāng)歸黃芪超濾膜提取物預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧損傷以及氧化損傷的心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用［11］。孫艷等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠通過穩(wěn)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位，通過線粒體凋亡途徑，有效抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［3］。

在分子水平對缺氧/復(fù)氧損傷后Bcl2、Baχ、Bnip3 m INA表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧損傷后Baχm INA表達(dá)顯著升高，Bcl2 m INA則明顯降低，而Bnip3 m INA水平亦降低，表明缺氧復(fù)氧損傷誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡通過線粒體凋亡途徑。當(dāng)歸補(bǔ)血湯預(yù)處理心肌細(xì)胞Bcl2 m INA表達(dá)升高，細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)減低。細(xì)胞色素C及其它凋亡分子的釋放受Bc12家族蛋白的調(diào)控［12］。BNIP3屬于BH3-on1y亞族，其通過BH3結(jié)構(gòu)可以與Bc12抗凋亡蛋白結(jié)合，抑制Bc12的抗凋亡作用，Bax和Bak可能與BNIP3聯(lián)合作用于線粒體，誘導(dǎo)IOS產(chǎn)生、膜電位消失和線粒體細(xì)胞色素C釋放導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。當(dāng)歸補(bǔ)血湯通過線粒體凋亡途徑，上調(diào)Bcl2 m INA表達(dá)，抑制細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)，提高心肌細(xì)胞抗凋亡能力，進(jìn)一步證明當(dāng)歸補(bǔ)血湯對線粒體功能損傷具有保護(hù)作用。

目前，已對缺血再灌注的分子機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究，其中以線粒體凋亡信號通路中的蛋白作為治療靶點(diǎn)篩選各種抑制劑已取得了一定的進(jìn)展，如勞丹烷型二萜能夠通過誘導(dǎo)蛋白激酶B（Akt）磷酸化和增加Bc12的表達(dá)［14］，異氟烷通過促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)，NO合成增加，促進(jìn)線粒體ATP敏感性鉀通道（mitoKATP）開放，抑制缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡［15］。然而單純一種藥物其作用靶點(diǎn)單一，很難取得較好的治療效果，臨床用藥受到限制。對當(dāng)歸補(bǔ)血湯主要組分黃芪及其黃芪主要成分黃芪多糖和黃芪皂苷的研究結(jié)果證實(shí)，黃芪可提高心肌細(xì)胞SOD的活性，清除自由基，并抑制脂質(zhì)過氧化作用，促進(jìn)糖原合成，抑制糖酵解并且糾正細(xì)胞內(nèi)酸中毒［16］，改善心肌細(xì)胞再灌注損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，激活線粒體ATP敏感鉀通道，減輕鈣超載等機(jī)制減輕缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷［17］。以上研究結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠作用多個(gè)靶點(diǎn)，在多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用。

傳統(tǒng)中藥復(fù)方藥效的發(fā)揮是各個(gè)化學(xué)組分獨(dú)立或相互綜合作用的結(jié)果，不僅對缺血/再灌注有良好的抑制作用，中藥兼有增強(qiáng)心功能和調(diào)節(jié)免疫等多方面的作用。但目前已知的對缺血/再灌注具有良好藥效的中藥單體及中藥復(fù)方尚少。尚需對當(dāng)歸補(bǔ)血湯在分子、細(xì)胞、動物模型不同方面對藥效進(jìn)行多水平、多方位、多靶點(diǎn)的系統(tǒng)性評價(jià)，對缺血再灌注損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制進(jìn)行更深入、廣泛而細(xì)致的研究，以期為臨床用藥提供理論依據(jù)。

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*通信作者：張志斌（1966—），女，主任技師，從事心管病方面研究。Te1：（0510）88859999-24509，E-mai1：491073429@qq.com

作者簡介：周春剛（1974—），男，碩士，副主任技師，從事心血管病方面研究。Te1：（0510）88859999-24509

基金項(xiàng)目：江蘇省無錫市科技局科技支撐發(fā)展項(xiàng)目（CSE01N1224）

收稿日期：2014-12-22

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.038

中圖分類號：I 285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）03-0658-04