劉家旺 范寧波 王愛(ài)霞 段玉鋒 王廷賢 楊占偉

（1福建省煙草公司南平市公司，福建南平 353000；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450002；3河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南鄭州 450016；4云南省煙草公司曲靖市公司，云南曲靖 655001）

氧氣是地球上絕大多數(shù)生物維持生命活動(dòng)的必需物質(zhì)之一，植物中的兩大生理活動(dòng)——呼吸作用和光合作用均離不開(kāi)氧氣參與[1]。然而，氧氣參與這些生理活動(dòng)往往會(huì)導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）等副產(chǎn)物的產(chǎn)生。ROS主要包括超氧陰離子（O2-）、氫氧根離子（OH-）、羥自由基（·OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2.）等物質(zhì)[2]。 高濃度的活性氧會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生一些害處，導(dǎo)致生物體氧化損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[3]，甚至導(dǎo)致基因突變[4]；適宜濃度的活性氧可以激活某些酶以及轉(zhuǎn)錄因子[5]。因此，活性氧也可以作為生物體的信號(hào)分子[6]。生物體中的活性氧會(huì)被一些酶類物質(zhì)清除，如 SOD、POD、CAT、APX等[7]。煙草（Nicotiana tabacum L.）屬于茄科煙草屬植物，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[8]，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。另外，煙草也是一種模式植物，在植物生命科學(xué)研究中發(fā)揮著十分重要的作用[9]。當(dāng)煙草遭遇外界脅迫時(shí)，會(huì)積累大量活性氧物質(zhì)[10-12]；煙葉在正常成熟發(fā)育過(guò)程中，也伴隨著活性氧積累[13]；不同的田間處理會(huì)導(dǎo)致煙葉活性氧積累的差距[14-15]。鑒于煙草生產(chǎn)的特殊地位，本文主要綜述了煙草中活性氧來(lái)源、活性氧功能以及一些常見(jiàn)的活性氧物質(zhì)測(cè)定方法，以期為進(jìn)一步研究煙草中活性氧提供一些參考。

1 煙草中活性氧的來(lái)源

1.1 非生物脅迫對(duì)活性氧的影響

1.1.1 干旱脅迫對(duì)活性氧的影響。水分是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，因而缺水干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最常見(jiàn)的因素之一。隨著水資源逐漸匱乏，旱情頻頻發(fā)生[16]。煙草是對(duì)干旱脅迫較敏感的一種作物，如果植株沒(méi)有得到充足的水分會(huì)導(dǎo)致一些生理障礙甚至死亡，嚴(yán)重影響煙葉生產(chǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致煙草中活性氧物質(zhì)的積累，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，抑制植物的光合和呼吸等重要生理活動(dòng)[17]，這可能是造成植物生理障礙的原因。王發(fā)展等[18]發(fā)現(xiàn)干旱條件能夠?qū)е翲2O2、O2-含量顯著增加；張 杰等[19]發(fā)現(xiàn)干旱條件使煙草幼苗中的H2O2和丙二醛（MDA）含量增加，使煙苗根系活力受阻。然而，外源施加5-氨基乙酰丙酸（ALA）、硫化氫（H2S）等物質(zhì)均能有效緩解該癥狀。

1.1.2 溫度脅迫對(duì)活性氧的影響。溫度脅迫主要分為高溫脅迫和低溫脅迫。煙草起源于美洲地區(qū)，是一種喜溫作物，對(duì)低溫脅迫尤其敏感。低溫脅迫會(huì)使煙草幼苗僵化、老化，大量研究表明，低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致煙草中活性氧的積累：顧開(kāi)元等[20]用4℃低溫處理煙草幼苗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)低溫處理的煙草幼苗中，其超氧陰離子和MDA含量明顯升高；馬曉寒等[21]發(fā)現(xiàn)低溫處理的煙草幼苗中H2O2、O2-含量顯著升高。高溫脅迫也會(huì)導(dǎo)致活性氧積累，并能使清除活性氧的酶發(fā)生鈍化：張 燕等[22]將煙草幼苗置于40℃高溫下進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)熱脅迫導(dǎo)致煙草葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)顯著受損，MDA和活性氧物質(zhì)含量明顯升高，葉片中葉綠素含量下降，SOD、CAT等抗氧化酶活性也隨之改變，然而，外源CaCl2的使用能夠有效改善這種不良狀態(tài)。

1.1.3 金屬離子脅迫對(duì)活性氧的影響。當(dāng)今土壤污染嚴(yán)重，而金屬離子的毒害是造成土壤污染的主要因素之一。劉 強(qiáng)等[23]發(fā)現(xiàn)，隨著鋁離子濃度升高，煙草葉片中O2-和H2O2含量均呈明顯升高趨勢(shì)，影響生物量積累，煙草中的鋁毒害與葉片ROS積累成正相關(guān)。鎘作為一種劇毒污染物，能夠嚴(yán)重毒害動(dòng)植物。煙草是一種可以富集鎘離子的植物，吳敏蘭等[24]通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究了鎘對(duì)翠碧1號(hào)、K326、云煙87等煙苗的影響，發(fā)現(xiàn)能夠反映脂質(zhì)過(guò)氧化作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)MDA的含量都呈逐漸增加趨勢(shì)，而POD、SOD等清除活性氧的酶類呈先增加后減少的趨勢(shì)。在一定范圍內(nèi)，POD、SOD與活性氧的量成正相關(guān)，然而，隨著鎘添加量增加，葉片中超氧化物的量超過(guò)了酶類的清除能力，破壞了酶系統(tǒng)，抑制了酶活性。

1.2 生物脅迫對(duì)活性氧的影響

煙草在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭受多種生物脅迫，最為常見(jiàn)的是一些病蟲(chóng)害對(duì)煙草產(chǎn)生的脅迫作用，常見(jiàn)的有煙草普通花葉病毒病（TMV）、煙草黃瓜花葉病毒病（CMV）、煙蚜、煙青蟲(chóng)等病蟲(chóng)害[25-26]。 張 萍等[27]通過(guò)將辣椒脈斑駁病毒和黃瓜花葉病毒接種到煙草上，并利用NBT染色法和DAB染色法，分別來(lái)定性觀察超氧離子和H2O2的產(chǎn)生和分布情況，發(fā)現(xiàn)病斑附近的染色較深，說(shuō)明病毒侵染會(huì)導(dǎo)致煙草病斑附近活性氧的產(chǎn)生和積累[27]。當(dāng)遭遇到害蟲(chóng)取食時(shí)，會(huì)通過(guò)產(chǎn)生ROS或鈣信號(hào)等對(duì)害蟲(chóng)作出相應(yīng)的抵御[8]。

1.3 煙葉自身成熟過(guò)程中活性氧的積累

煙葉成熟度被認(rèn)為是影響煙葉質(zhì)量的首要因素，也是保證和提高烤后煙葉品質(zhì)及其工業(yè)可用性的前提條件[28-29]。我國(guó)煙葉與其他國(guó)家的優(yōu)質(zhì)煙葉相比，最明顯的缺陷是煙葉成熟度不足，尤其是煙葉“上六片”成熟度不足，嚴(yán)重影響了國(guó)內(nèi)上部煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量[30]。在煙葉成熟過(guò)程中，活性氧逐漸積累，因而可以將活性氧作為衡量煙葉成熟度的指標(biāo)。從煙葉的未熟階段到適熟階段，SOD和CAT活性下降緩慢，膜脂過(guò)氧化速度緩慢，活性氧積累少，在適熟期之后，膜脂過(guò)氧化速度顯著提高，活性氧積累較多[31]。在煙草生命周期中，煙草植株需要進(jìn)行呼吸作用和光合作用，而線粒體和葉綠體[32-33]是煙草活性氧的重要來(lái)源。葉綠體中產(chǎn)生的活性氧會(huì)導(dǎo)致葉片失綠和葉肉細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致葉片中的葉綠素含量降低，光合作用受到抑制，物質(zhì)合成速度減慢，極大地影響了煙葉生長(zhǎng)發(fā)育。線粒體是生物體進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所，線粒體上的許多位點(diǎn)都能產(chǎn)生活性氧。線粒體上所進(jìn)行的有氧呼吸的產(chǎn)物大部分是水，但也有一小部分的產(chǎn)物是活性氧?；钚匝鯐?huì)對(duì)線粒體造成嚴(yán)重?fù)p害，影響煙葉ATP合成，影響煙葉生命活動(dòng)[34-35]。

2 活性氧在煙草中的功能

2.1 提高煙草的抗逆能力

活性氧系統(tǒng)并非只能給植物帶來(lái)害處，也會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生積極影響。有研究表明，適當(dāng)濃度的活性氧可以作為信號(hào)分子誘導(dǎo)植物體防御基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力?；钚匝蹙哂屑?xì)胞毒性，是植物的一種自我保護(hù)機(jī)制。石永春等[36]通過(guò)對(duì)煙草品種K326噴施海藻糖水，發(fā)現(xiàn)海藻糖可能通過(guò)誘導(dǎo)煙葉中活性氧的產(chǎn)生，提高葉片中的H2O2含量，激活抗病基因表達(dá)而增強(qiáng)煙草對(duì)煙草花葉病毒（TMV）的抗病性。Abbink等[37]利用酵母雙雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)某種活性氧的相關(guān)基因不表達(dá)時(shí)，煙草花葉病毒量增加，這也在一定程度上證明活性氧參與了煙草的抗病性反應(yīng)。魯 琳等[38]發(fā)現(xiàn)，在遭遇鹽脅迫時(shí)，煙草中活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著改變。這些結(jié)果表明，活性氧的清除是花煙草抵御鹽脅迫的重要機(jī)制之一。

2.2 參與煙草的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

活性氧作為細(xì)胞中的第二信使，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，引導(dǎo)植物產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)[39]。王 寧等[40]利用外源H2O2處理煙草植株，導(dǎo)致煙草幼苗中的H2O2和O2-含量迅速增加，改變了煙草葉片和花芽的發(fā)育狀況，表明煙草體內(nèi)活性氧變化能夠顯著影響煙草發(fā)育進(jìn)程。另外，ROS信號(hào)能夠?qū)χ参镏蠧a2+有一定的調(diào)控作用，也能夠作為信號(hào)分子刺激植物激素的合成和運(yùn)輸，進(jìn)而控制植物生長(zhǎng)發(fā)育[41]。

3 活性氧的測(cè)定方法

活性氧性質(zhì)活潑，因而只能間接定量測(cè)定或者進(jìn)行定性測(cè)定，活性氧的測(cè)定一般使用分光光度法進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)，也可以使用染色法進(jìn)行簡(jiǎn)便的定性監(jiān)測(cè)。利用NBT（氯化硝基四氮唑藍(lán)）光還原染色法可以測(cè)定超氧陰離子在生物體內(nèi)的分布和相對(duì)含量，DAB（二氨基聯(lián)苯胺）染色可以顯示煙草體內(nèi)H2O2的分布和大致含量[42]，可以利用熒光探針直接定量測(cè)定線粒體活性氧的形成[43]?；钚匝蹼y以直接測(cè)定，且測(cè)定過(guò)程和結(jié)果容易受到各種因素的影響，因而往往需要多個(gè)指標(biāo)，如MDA和游離脯氨酸的配合。

4 結(jié)語(yǔ)

煙草作為一種可以影響國(guó)民經(jīng)濟(jì)的特殊經(jīng)濟(jì)作物，針對(duì)煙草的研究具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。很多因素可以誘使煙草積累活性氧，高濃度的活性氧會(huì)導(dǎo)致植株衰老甚至死亡，然而適量濃度的活性氧會(huì)對(duì)植株產(chǎn)生一定的積極影響。目前，病蟲(chóng)害的危害已經(jīng)成為阻礙煙草行業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素[29]，而活性氧可以激活煙草的抗蟲(chóng)抗病機(jī)制。因此，關(guān)于活性氧的研究有助于了解植物抵抗病蟲(chóng)害的機(jī)制，并為煙草的抗蟲(chóng)抗病提供新思路[44]。