娜仁滿都拉， 白梅榮， 桂 榮， 烏日漢， 巴根那（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000）

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紅花混懸液抗D-氨基半乳糖致大鼠肝細(xì)胞凋亡的機(jī)理研究

娜仁滿都拉， 白梅榮*， 桂 榮， 烏日漢， 巴根那
（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000）

摘要：目的 初步探討紅花混懸液對(duì)D-氨基半乳糖（D-Ga1N）誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)理。方法 以D-Ga1N誘導(dǎo)建立大鼠急性肝損傷模型，觀察紅花混懸液對(duì)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、肝細(xì)胞凋亡及肝組織病理作用變化。結(jié)果 紅花混懸液明顯降低急性肝損傷大鼠血清ALT、AST活性，提高血清和肝組織GSH-Px含有量，降低細(xì)胞凋亡程度，有效減輕D-Ga1N所致的肝組織病理改變。結(jié)論 抑制肝細(xì)胞凋亡是紅花抗急性肝損傷的作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：紅花混懸液；D-氨基半乳糖；大鼠；細(xì)胞凋亡；肝損傷

紅花是菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，是蒙醫(yī)臨床常用的藥材之一。在傳統(tǒng)蒙藥學(xué)理論指導(dǎo)下的紅花被譽(yù)為“肝臟之好”，在保肝作用的常用蒙藥復(fù)方古日古木-13、古日古木-7、額力根湯等十幾個(gè)蒙藥復(fù)方的配伍組成中扮演著“君藥”作用［1］。紅花被《中華本草·蒙藥卷》（2004年版）收載，性涼、味微苦、具有重、鈍、柔、和、固等性能；具有涼血、鎖脈、調(diào)經(jīng)、清肝、強(qiáng)身、止痛、消腫作用等功效。主要用于肝熱，月經(jīng)不調(diào)，嘔血，鼻衄，外傷出血，血熱疼痛，心熱，血熱等病癥［2］。本實(shí)驗(yàn)以建立大鼠D-氨基半乳糖（D-Ga1N）急性肝損傷模型，觀察紅花對(duì)血清和肝組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPx）含有量變化及防止急性肝損傷細(xì)胞凋亡的作用，初步探討其紅花混懸液抗急性損傷的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD種雄性大鼠，體質(zhì)量為（200±10）g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，SCKK（吉）-2011-0004。

1.2 藥品與試劑 紅花由內(nèi)蒙古民族大學(xué)提供，護(hù)肝片（廣東康爾丹制藥有限公司，批號(hào)Z20054567）；D-Ga1N購(gòu)自北京拜迪生物有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（G0033）、PBS（ST476）、無(wú)毒環(huán)保HE染液（D006）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。無(wú)水乙醇（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）；二甲苯（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器 羅氏全自動(dòng)生化分析儀（上海同舸醫(yī)療器械有限公司）；TGL-20B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BD Ca1ibur型流式細(xì)胞儀（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）；CX31型顯微鏡成像系統(tǒng)（北京瑞科中儀科技有限公司）；KD1508型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 紅花混懸液制備方法 紅花混懸液小劑量的制備方法為把人的每天口服劑量5 g（設(shè)人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量為70 kg）按體表面積的計(jì)算方法換算為大鼠的劑量0.43 g/kg。即稱(chēng)取0.43 g紅花粉末，加0.5% CMC-Na溶液20 mL（每100 g體質(zhì)量大鼠灌胃2 mL溶液），配制成為0.021 5g/mL溶液；紅花混懸液大劑量的制備方法為根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)大劑量為小劑量的9倍。即稱(chēng)取3.87 g紅花粉末，加0.5% CMC-Na溶液20 mL，配制成為0.193 5 g/mL溶液。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 將50只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5個(gè)組，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、紅花混懸液大劑量組（3.87 g/kg）、紅花混懸液小劑量組（0.43 g/kg）、護(hù)肝片陽(yáng)性對(duì)照組（0.36 mg/kg），每組10只。從實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始，各給藥組灌胃相應(yīng)的藥物溶液，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃21 d，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等量CMC-Na溶液。末次給藥0.5 h后，除了正常對(duì)照組外，其余各組按照300 mg/kg劑量腹腔注射D-Ga1N生理鹽水溶液，建立急性肝損傷模型。禁食不禁水的條件下，20 h后用10%的水合氯醛麻醉動(dòng)物，從腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/mim離心10 min分離血清，測(cè)定AST、ALT和GSH-Px值，取部分肝組織在10%甲醛中固定，按HE染色常規(guī)要求進(jìn)行修塊、脫水、浸蠟、包埋，待觀察各組病理組織學(xué)變化；取部分肝組織-80℃凍存，待測(cè)定肝組織GSH-Px值，并觀察肝細(xì)胞凋亡變化。

2.3 流式細(xì)胞儀分析 取大鼠肝組織，分離肝細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞1次（1 000 r/min離心5 min）收集并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL的混懸液；Fa1con試管中加入100 μL細(xì)胞混懸液；依次加入500 μL結(jié)合液、5 μL Annexin V及5 μL核酸染料；輕輕混勻，室溫（20～25℃）避光處放置10 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅花混懸液對(duì)血清ALT，AST水平的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清AST和ALT活性均顯著升高，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明急性肝損傷模型復(fù)制成功。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清AST和ALT活性均顯著降低，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，紅花混懸液大劑量組和小劑量組大鼠血清AST和ALT活性均顯著降低，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紅花混懸液對(duì)大鼠血清ALT和AST水平的影響（±s，n＝8）

表1 紅花混懸液對(duì)大鼠血清ALT和AST水平的影響（±s，n＝8）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　ALT/（U·L-1）　AST/（U·L-1）正常對(duì)照組　35.91±10.09**　94.31±15.00**模型對(duì)照組　627.51±282.81　 622.43±257.12陽(yáng)性對(duì)照組　295.17±85.52*　315.90±84.63*紅花混懸液小劑量組　292.46±161.53*　333.05±151.51*紅花混懸液大劑量組　285.52±155.86*　381.82±174.31*

3.2 紅花混懸液對(duì)血清和肝組織GSH-Px水平的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肝組織和血清GSH-Px活性明顯降低，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，紅花混懸液小、大劑量組肝組織和血清GSHPx活性明顯升高，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組血清GSH-Px明顯升高，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但肝組織GSH-Px有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 紅花混懸液在小鼠血清和肝組織中GSH-Px的含有量變化（±s，n＝8）

表2 紅花混懸液在小鼠血清和肝組織中GSH-Px的含有量變化（±s，n＝8）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別　　肝組織GSH-Px/ （U·mg-1）血清GSH-Px/ （U·mg-1）正常對(duì)照組　411.13±89.84*　4 586.40±1 839.39*模型對(duì)照組　339.43±84.50　 2 286.00±1 186.89陽(yáng)性對(duì)照組　403.24±114.52　 3 834.51±1 808.48*紅花混懸液小劑量組　562.71±165.36*3 611.52±238.88*紅花混懸液大劑量組　582.14±112.78**4 928.91±1 212.73**

3.3 紅花混懸液對(duì)D-Ga1N所致大鼠急性肝損傷組織病理變化的影響 正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞索排列整齊，肝竇正常，肝細(xì)胞無(wú)明顯病變，核結(jié)構(gòu)清晰。模型對(duì)照組肝小葉處肝細(xì)胞明顯壞死或變性，損傷較重的肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重，在壞死細(xì)胞周?chē)?jiàn)到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，在肝小葉間及肝竇處見(jiàn)到腫脹血管。紅花大劑量肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝總管及肝竇處血管腫脹現(xiàn)象明顯緩解且炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見(jiàn)少量壞死肝細(xì)胞；紅花小劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)不全面，肝小葉及肝總管周?chē)砸?jiàn)到變性肝細(xì)胞、炎細(xì)胞及少量的壞死和腫脹肝細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)趨于正常，肝總管及肝竇處可見(jiàn)少量的腫脹血管及炎細(xì)胞，可見(jiàn)到新生雙核肝細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)各組大鼠肝組織病理變化（HE染色，×100）

3.4 紅花混懸液對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的肝細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和小、大劑量紅花混懸液組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示紅花混懸液具有抑制肝細(xì)胞凋亡作用。結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表3 紅花混懸液對(duì)D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝8）

表3 紅花混懸液對(duì)D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝8）

注：與模型對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別　　動(dòng)物數(shù)/只　　細(xì)胞凋亡指數(shù)正常對(duì)照組　8　0.22±0.03**模型對(duì)照組　8　3.03±0.94陽(yáng)性對(duì)照組　8　0.18±0.02**紅花混懸液小劑量組　8　0.19±0.04**紅花混懸液大劑量組　8　0.17±0.05**

4 討論

蒙醫(yī)學(xué)是以三根學(xué)說(shuō)（赫依、希拉、巴達(dá)干，近似中醫(yī)的氣、熱、寒）解釋機(jī)體生理和病理現(xiàn)象，而蒙藥是蒙醫(yī)防治疾病的有力武器。大部分蒙藥材來(lái)源與中藥材相同。蒙藥主要以蒙醫(yī)基礎(chǔ)理論和蒙藥藥性理論為指導(dǎo)，在加工制作和用法上具備了蒙藥特色。即蒙藥以蒙藥的十七種效能來(lái)補(bǔ)偏救弊，調(diào)整機(jī)體內(nèi)部的“三根”的偏盛和偏衰，可達(dá)到防病、治病和健身的目的。紅花雖然是中蒙藥通用的藥材，但在蒙藥藥性理論和蒙醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，在肝臟疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用。因而被譽(yù)為“肝臟之好”［3］的美名。大量的臨床資料也均證實(shí)，紅花為君藥的蒙藥復(fù)方制劑是肝臟的急性和慢性疾病的首選藥物。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

肝細(xì)胞的異常凋亡在急、慢性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［4-5］，從肝細(xì)胞異常凋亡的角度觀察保肝藥物的作用及機(jī)制具有重要意義。在某些類(lèi)型肝病中，肝細(xì)胞凋亡實(shí)際上引起了炎癥和壞死，肝臟中的嗜中性白細(xì)胞炎癥完全依賴于細(xì)胞凋亡的這一始發(fā)事件。因此阻止細(xì)胞凋亡可能是一個(gè)新的控制炎癥的治療途徑。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，紅花混懸液大、小劑量組均明顯抑制肝細(xì)胞凋亡數(shù)。說(shuō)明抑制凋亡是紅花抗肝損傷、保護(hù)肝細(xì)胞的作用機(jī)理之一。本實(shí)驗(yàn)可為紅花保肝作用的進(jìn)一步系統(tǒng)研究提供科學(xué)依據(jù)。

紅花性涼、味微苦、具有重、鈍、柔、和、固等性能；具有涼血、清肝等功效。蒙醫(yī)臨床資料顯示，在蒙醫(yī)理論指導(dǎo)下的紅花可用于防治多種因素導(dǎo)致的肝臟疾病并效果較突出。

肝細(xì)胞的損傷是一種由多因素介導(dǎo)的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，損傷的結(jié)果是肝細(xì)胞可能發(fā)生凋亡或壞死［6-8］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，亦稱(chēng)程序性死亡［9］，由于其特殊的生物學(xué)意義而逐步成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究表明，細(xì)胞凋亡在肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要的作用。關(guān)于肝細(xì)胞死亡機(jī)制的研究將對(duì)肝臟疾病的預(yù)防和治療起重要的作用［10］。D-氨基半乳糖模型機(jī)制可耗竭肝細(xì)胞內(nèi)三磷酸尿嘧啶核苷，抑制INA合成［11-13］而達(dá)到肝細(xì)胞凋亡，近幾年的研究認(rèn)為D-氨基半乳糖模型機(jī)制還與肝細(xì)胞膜的

完整性、過(guò)氧化損傷、谷胱甘肽耗竭［14］及腫瘤壞死因子［15］有關(guān)。機(jī)體存在阻止過(guò)氧化作用的防御體系，GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用的酶性保護(hù)系統(tǒng)的主要成分，可催化過(guò)氧化脂質(zhì)（LPO）分解生成相應(yīng)的醇，防止LPO均裂和引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用的鏈?zhǔn)街ф湻磻?yīng)，減少LPO的生成，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模劑D-G1aN可致大鼠肝細(xì)胞大量凋亡、同時(shí)顯著降低其GSH-Px水平。紅花混懸液大小劑量組均明顯抑制肝細(xì)胞凋亡，并明顯提高了血清和肝組織GSH-Px的含有量。因此，認(rèn)為D-G1aN致急性肝損傷的機(jī)制可能通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞的過(guò)氧化損傷而引發(fā)了肝細(xì)胞的大量凋亡。而通過(guò)恢復(fù)GSH-Px抗氧化功能其保護(hù)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性為紅花抑制肝細(xì)胞凋亡而起到保肝作用的目的。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 王秀梅，韓曉靜，白梅榮，等.HPLC法測(cè)定紅花地上部分羥基紅花黃色素A和木犀草素的含量［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2014，8（2）：29-30.

［2］ 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：蒙藥卷［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004：9.

［3］ 韓曉靜，雙 榮，白梅榮，等.紅花莖醇提物的保肝作用機(jī)理研究［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014，4（2）：101-102.

［4］ 姜澤群，姚志華，鄧正亭，等.涼血化瘀方拮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的L02肝細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38（20）：3544-3548.

［5］ 王鳳林，楊宏志，李楊湄，等.基于茵陳蒿湯及大承氣湯的清下法防治急性內(nèi)毒素性肝損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究［J］.中藥材，2014，37（5）：848-852.

［6］ 張虹莉，胡少青，伍義行，等.苦參素對(duì)D-氨基半乳糖苷誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的干預(yù)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（14）：6130-6133.

［7］ 張向穎，郭媛媛，張 莉，等.氧化應(yīng)激介導(dǎo)糖原合成酶激酶-3β促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（1）：27-31.

［8］ Liu LM，Zhang JX，Luo J，etal.A ro1e of ce11apoptosis in 1ipopo1ysaccharide（LPS）-induced non1etha1 1iver injury in D-ga1actosamine（D-Ga1N）-sensitized rats［J］.Dig Dis Sci，2008，53（5）：1316-1324.

［9］ 李素婷，吳淑彥，杜 超，等.山楂葉總黃酮對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2015，35（7）：1889-1891.

［10］ 劉 浩，鄭 勇，陳衛(wèi)剛，等.內(nèi)源性硫化氫對(duì)肝硬化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響［J］.世界華人消化雜志，2012，20 （8）：670-674.

［11］ Watanabe T，Jono H，Han J，et al.Synergistic activation of NF-kappaB by nontypeab1e Haemophilus influenzae and tumor necrosis factor a1pha［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101 （10）：3563-3568.

［12］ 李達(dá)民，關(guān)養(yǎng)時(shí).梗阻性黃疸致肝細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)普通外科雜志，2014，32（7）：967-971.

［13］ Kepp1er D，F(xiàn)r?h1ich J，Ieutter W，et al.Changes in uridine nuc1eotides during 1iver perfusion with D-ga1actosamine［J］. FEBS Lett，1969，4（4）：278-280.

［14］ 閻 寧，許瑞齡.馬來(lái)酸二乙酯對(duì)半乳糖胺脂多糖致小鼠急性肝損傷發(fā)生中核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響［J］.山西醫(yī)藥雜志，2003，32（6）：538-539.

［15］ Stach1ewitz I F，Seabra V，Bradford B，etal.G1ycine and uridine prevent D-ga1actosamine hepatotoxicity in the rat：ro1e of Kupffer ce11s［J］.Hepatolotgy，1999，29（2）：737-745.

*通信作者：白梅榮（1972—），女（蒙古族），教授，從事蒙藥藥理毒理學(xué)研究。Te1：15804758404

作者簡(jiǎn)介：娜仁滿都拉（1990—），女（蒙古族），從事蒙藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mai1：15247533325@163.com

基金項(xiàng)目：通遼市科技合作項(xiàng)目（SXYB2012030）；內(nèi)蒙古民族大學(xué)校級(jí)研究生資助項(xiàng)目（NMDSS1436）

收稿日期：2015-03-17

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.037

中圖分類(lèi)號(hào)：I285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0655-04