楊曉歐，張夢云，馮翔宇，彭玉娟，李秀華

(1 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2 滄州市人民醫(yī)院；3 泰安市第一人民醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

曲美他嗪對慢性心力衰竭大鼠腎功能的保護作用及其機制

楊曉歐1，張夢云1，馮翔宇2，彭玉娟3，李秀華1

(1 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2 滄州市人民醫(yī)院；3 泰安市第一人民醫(yī)院)

摘要：目的探討曲美他嗪作為心臟保護藥物治療大鼠慢性心力衰竭(CHF)的同時對腎功能的保護作用及其機制。方法40只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組15只、造模組25只。制作CHF模型后，造模組再隨機分為模型組、曲美他嗪組，最終選取假手術(shù)組、模型組、曲美他嗪組各10只進行研究。采用多媒體生物信號記錄儀記錄各組左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室壓力最大上升或下降速率(±dp/dtmax)；采用 HE及Masson染色方法光鏡下觀察腎組織的結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學法定性檢測各組腎組織血小板源性生長因子-B(PDGF-B)蛋白表達，蛋白印跡法半定量檢測各組腎組織PDGF-B 蛋白表達，RT-PCR測定各組腎組織PDGF-B mRNA表達。結(jié)果與模型組比較，曲美他嗪組±dp/dtmax明顯升高，LVEDP明顯降低，PDGF-B 蛋白表達和PDGF-B mRNA水平明顯降低(P均<0.01)。結(jié)論曲美他嗪在改善CHF大鼠心功能的同時也可能通過抑制PDGF-B的表達對腎功能起到保護作用。

關(guān)鍵詞：心力衰竭；腎間質(zhì)纖維化；曲美他嗪；血小板源性生長因子-B；大鼠

慢性心力衰竭(CHF)是一種復雜的臨床癥候群，是各種心臟病的終末階段，患者在心臟泵功能降低的同時往往伴有腎、肺及肝臟功能異常[1]。多項研究證明，心力衰竭患者伴隨腎功能不全會明顯增加住院率及病死率，且心力衰竭與腎功能不全形成惡性循環(huán)，進一步造成心腎功能惡化。因此，在治療心力衰竭的同時，對腎臟功能保護也不容忽視。2013年9月～2015年6月，我們通過觀察曲美他嗪治療CHF大鼠腎組織血小板源性生長因子-B(PDGF-B)表達的變化，以探討其對腎臟功能的保護作用及其機制。

1材料與方法

1.1 CHF動物模型制備及分組 清潔雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量210～230 g，9～10周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。將大鼠隨機分為假手術(shù)組15只、造模組25只。各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g)麻醉，分層切開腹部，分離出左腎上腹主動脈。假手術(shù)組只分離左腎上腹主動脈不結(jié)扎，造模組分離左腎上腹主動脈后結(jié)扎。各組大鼠術(shù)后均給予青霉素20萬U連續(xù)3 d腹腔注射。術(shù)后由于手術(shù)應激或天氣等因素，假手術(shù)組死亡1只，造模組死亡5只。常規(guī)喂養(yǎng)4周后，檢測心臟血流動力學參數(shù)，以左心室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg作為CHF成模標準。待成功建立模型后，將造模組隨機分為模型組與曲美他嗪組，每組10只；假手術(shù)組隨機選取10只。曲美他嗪組給予曲美他嗪10 mg/(kg·d)灌胃，模型組和假手術(shù)組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

1.2血流動力學檢測 待測大鼠仰臥固定于手術(shù)臺，腹腔注射3%戊巴比妥鈉鹽溶液麻醉成功后行頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈，結(jié)扎遠心端，動脈夾夾閉近心端。在結(jié)扎處與動脈夾之間剪一小口，向心方向插入導管，松開動脈夾，直至左心室，導管另一端接入壓力換能器。在多媒體生物信號記錄儀上記錄并分析LVEDP、左心室壓力最大上升或下降速率(±dp/dtmax)。

1.3腎臟病理檢查 雙側(cè)腎臟取材，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水包埋，石蠟標本連續(xù)切片制成3 μm厚切片，行HE及Masson染色觀察腎組織病理變化。Masson染色結(jié)果采用Image-Pro Plus 6．0軟件分析，計算膠原纖維面積/所測視野面積比值。每個標本隨機選取3個視野進行測定，取平均值。

1.4腎組織PDGF-B 表達檢測①免疫組織化學法定性檢測各組大鼠腎組織PDGF-B蛋白表達：兔抗大鼠PDGF-B多克隆抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，試劑盒購自北京四正柏生物有限公司。PDGF-B一抗工作濃度1∶100，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。PDGF-B陽性信號均為淺黃色至深棕色顆粒，以免疫陽性產(chǎn)物區(qū)域面積表示該抗原的相對含量。每個標本隨機選取4個視野，進行積分光度(IOD)的測定，取平均值。②蛋白印跡法半定量檢測各組大鼠腎組織PDGF-B蛋白表達：稱量100 mg腎組織，按照試劑盒步驟提取組織總蛋白，應用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定總蛋白含量，根據(jù)蛋白含量計算合適的上樣量。取40 μg蛋白樣品上樣，進行變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗，ECL化學發(fā)光試劑曝光顯影，Quantity One軟件分析結(jié)果，以β-actin表達水平作為內(nèi)參。③RT-PCR測定各組大鼠腎組織PDGF-B mRNA水平：取100 mg腎組織，用Trizol提取腎組織中總RNA，并測量總RNA的濃度和純度。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像，以PDGF-B與β-actin條帶的吸光度比值作為PDGF-B mRNA的表達。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血流動力學參數(shù)比較與假手術(shù)組比較，模型組LVEDP明顯升高，±dp/dtmax明顯降低(P均<0.01)。與模型組比較，曲美他嗪組±dp/dtmax明顯升高，LVEDP明顯降低(P均<0.01)。

表1　各組大鼠血流動力學指標比較±s)

2.2各組腎臟組織病理變化 HE染色：假手術(shù)組腎臟未見明顯的組織學變化，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。模型組腎小管擴張，腎小管上皮細胞水腫，細胞排列紊亂，腎小球結(jié)構(gòu)完整；腎間質(zhì)增寬，淋巴細胞和單核巨噬細胞灶狀浸潤。曲美他嗪組腎小管擴張及腎小管上皮細胞水腫減輕，細胞排列較紊亂，腎小球結(jié)構(gòu)完整。Masson染色各組腎小管間質(zhì)膠原纖維面積及其與視野面積比值見表2。

表2　Masson染色各組腎小管間質(zhì)膠原纖維面積

注：與假手術(shù)組比較，aP<0．01；與模型組比較，bP<0．01。

2.3各組腎組織PDGF-B 表達見表3。

表3　各組大鼠腎組織PDGF-B蛋白及mRNA 表達

注：與假手術(shù)組比較,aP<0．01；與模型組比較,bP<0．01。

3討論

研究表明，心血管疾病往往伴隨慢性腎臟疾病，而這兩種疾病同時存在使得心血管事件和死亡的發(fā)生風險增加4～6倍，心血管疾病的進展可導致腎功能持續(xù)性惡化[2]。其中CHF導致腎纖維化的原因如下：① CHF發(fā)生時，患者心輸出量降低，有效循環(huán)血量不足，腎灌注減少，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS系統(tǒng))。RAAS激活血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及醛固酮的釋放，AngⅡ通過蛋白激酶C通路啟動細胞內(nèi)氧化應激，產(chǎn)生大量活性氧自由基，造成腎間質(zhì)纖維化[3~5]；②CHF發(fā)生時，患者靜脈壓增加，出球小動脈收縮、出球小動脈栓塞等均可使腎小球囊內(nèi)壓增高，而使腎小球囊內(nèi)壓增高是引起腎臟增生性變化的最重要因素[6]。

研究認為，腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生以細胞外基質(zhì)(ECM)的過多沉積為主要特征，在引起ECM沉積的機制中，多種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子- β、結(jié)締組織因子、PDGF參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。其中PDGF家族中 PDGF-B在腎臟纖維化中起著主要的中介作用。有研究證實PDGF-B可促使肌成纖維細胞的形成和Ⅲ型膠原的沉積[7]，從而導致ECM的堆積發(fā)展成腎間質(zhì)纖維化。

本研究證實，曲美他嗪可改善CHF患者的心功能，其機制與其改善心肌代謝[8]、保護心肌細胞線粒體功能有關(guān)[9]。Masson染色結(jié)果證實，模型組大鼠心力衰竭8周后，發(fā)生腎小管間質(zhì)纖維化，腎小球纖維化不明顯；與模型組相比，曲美他嗪組腎小管間質(zhì)纖維化明顯減輕。本研究模型組大鼠PDGF-B蛋白表達及mRNA的表達較假手術(shù)組均明顯增高，提示PDGF-B在腎間質(zhì)纖維化中有重要的致病作用；而在曲美他嗪組PDGF-B表達較模型組明顯降低，表明曲美他嗪可延緩慢性心力衰竭后引起的腎小管間質(zhì)纖維化進展，同時也體現(xiàn)了對腎功能的保護作用。曲美他嗪對腎功能的保護作用機制為：①直接或間接抑制PDGF-B的表達，使腎小管間質(zhì)纖維化延緩；②清除氧自由基和抗氧化活性而抑制氧化應激[10]，從而延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

綜上所述，曲美他嗪治療慢性心力衰竭時，不僅改善心功能，還可以對腎功能產(chǎn)生保護作用。曲美他嗪對腎功能的保護效應可能通過抑制腎組織中PDGF-B的表達而實現(xiàn)。其具體機制尚需進一步研究。

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(收稿日期：2015-11-15)

中圖分類號：R541.6

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)05-0023-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.008

通信作者：李秀華(E-mail:lixiuhua76@126.com)

基金項目：河北省衛(wèi)生計生委資助課題(20110180)。