王夢(mèng)瑩，秦淑蘭，賴(lài)曉陽(yáng)

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌330006)

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二甲雙胍對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

王夢(mèng)瑩，秦淑蘭，賴(lài)曉陽(yáng)

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌330006)

摘要：目的探討二甲雙胍對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa 細(xì)胞增殖的影響及可能的作用機(jī)制。方法 以不同濃度(0、1、5、10 mmol/L)的二甲雙胍作用于Ishikawa 細(xì)胞分別干預(yù)24、48、72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率；干預(yù)48 h后，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因(REDD1)mRNA的表達(dá)，Western blotting技術(shù)檢測(cè)mTOR和REDD1蛋白的表達(dá)。結(jié)果二甲雙胍抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖，呈濃度時(shí)間依賴(lài)性(P均<0.05)。二甲雙胍增加REDD1蛋白及基因的表達(dá)，降低mTOR蛋白及基因的表達(dá)(P均<0.05)。結(jié)論 二甲雙胍可能通過(guò)REDD1/mTOR信號(hào)通路抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：子宮腫瘤；二甲雙胍；雷帕霉素靶蛋白；DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因；細(xì)胞增殖

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性。在我國(guó)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年上升,并且呈年輕化趨勢(shì),居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位。目前流行病學(xué)證據(jù)表明，腫瘤的發(fā)生率與糖尿病以及某一特定糖尿病風(fēng)險(xiǎn)因素、糖尿病治療有關(guān)[1]。二甲雙胍作為治療糖尿病的一線(xiàn)藥物，具有抗腫瘤的多種生物活性，目前受到人們的廣泛關(guān)注。新的ORIGIN研究證明胰島素并沒(méi)有致腫瘤的作用[2]，但是對(duì)二甲雙胍抗腫瘤的作用目前仍沒(méi)有統(tǒng)一說(shuō)法[3]。2013年11月~2014年10月，本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討不同濃度的二甲雙胍對(duì)細(xì)胞增殖及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因(REDD1)表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于索萊寶科技有限公司；胎牛血清購(gòu)于長(zhǎng)城生物科技有限公司；二甲雙胍由百時(shí)美施貴寶公司贈(zèng)予；MTT試劑盒、Western blotting法試劑購(gòu)于南京凱基生物科技有限公司；GAPDH鼠mAb、mTOR 兔 pAb、REDD1兔 pAb、山羊抗鼠 IgG、山羊抗兔 IgG購(gòu)于proteintech公司；mTOR及REDD1擴(kuò)增引物序列購(gòu)于南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L、谷氨酸鹽2 mmol/L。37 ℃、5% CO2條件下2~3 d換液1次，達(dá)匯片后按5×105/瓶接種于25 cm2培養(yǎng)瓶。干預(yù)前用無(wú)血清RPMI1640洗2次，先用含0．1%牛血清白蛋白的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，進(jìn)行分組，分別為二甲雙胍1、5、10 mmol/L組和對(duì)照組(二甲雙胍濃度為0 mmol/L)，以等體積無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基替代二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)。

1.3細(xì)胞增殖率的測(cè)算采用MTT法。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，邊緣孔用無(wú)菌PBS填充，37 ℃、5% CO2孵育。二甲雙胍分別干預(yù)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h(注意避光)。終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min。于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)孔A值490-空白孔A值490)/(對(duì)照孔A值490-空白孔A值490)]×100%。

1.4細(xì)胞mTOR、REDD1 mRNA的檢測(cè)采用RT-PCR法。按照TRIzol操作說(shuō)明方法提取細(xì)胞總RNA。目的基因和內(nèi)標(biāo)基因GAPDH的反應(yīng)均在ABI PRISM 7300 Fast Real-Time PCR System 上進(jìn)行。mTOR擴(kuò)增序列上游引物5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3′,下游引物5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′。REDD1擴(kuò)增序列上游引物5′-TGGGCAAAGAACTACTGCG-3′, 下游引物5′-AGAGTTGGCGGAGCTAAACAG-3′。GAPDH擴(kuò)增序列上游引物5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3′，下游引物5′-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3′。PCR反應(yīng)體系20 μL:Mix 10 μL，PCR Forward Primer(10 μm) 1 μL, PCR Reverse Primer(10 μm) 1 μL,cDNA樣本 2 μL,RNageFree dH2O 6 μL。兩步法PCR反應(yīng)條件：37 ℃逆轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃、5 s；94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 30 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸 8 min。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.5細(xì)胞mTOR、REDD1蛋白的檢測(cè)采用Western blotting法。收集對(duì)數(shù)期的Ishikawa細(xì)胞，以2×105/孔接種于6 cm培養(yǎng)皿，不同濃度的二甲雙胍作用48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配制不同濃度的分離膠(GAPDH和REDD1用10%的分離膠，mTOR用8%的分離膠)，PBS調(diào)整蛋白濃度使之一致后加入蛋白上樣緩沖液煮沸5~10 min，上樣。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)剛離開(kāi)分離膠即終止電泳，根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Marker切膠，制成海綿墊、濾紙、目的凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊“三明治”進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min。WB封閉液室溫封閉1 h，加一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，加相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗

稀釋液室溫孵育1 h。滴加ECL發(fā)光試劑至PVDF膜表面，曝光、定影X線(xiàn)片后，應(yīng)用Image J軟件對(duì)X光片電泳條帶斑點(diǎn)密度掃描的灰度值進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖率的比較不同濃度的二甲雙胍干預(yù)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，隨著二甲雙胍濃度的增加，細(xì)胞增殖率有降低的趨勢(shì)，10 mmol /L的二甲雙胍抑制細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖率的比較±s)

注：與對(duì)照組同時(shí)間比較，*P<0.05；與二甲雙胍1 mmol/L組比較，#P<0.05；與二甲雙胍5 mmol/L組比較，ΔP<0.05。

2.2各組REDD1、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)表2。

表2 　各組REDD1、mTOR mRNA及蛋白表達(dá)的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與二甲雙胍1 mmol/L組比較，#P<0.05；與二甲雙胍5 mmol/L組比較，ΔP<0.05。 3討論

眾所周知，糖尿病的發(fā)病率逐年增高，糖尿病與腫瘤之間的關(guān)系也成為研究熱點(diǎn)。一些研究證實(shí)，乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤在2型糖尿病患者中的風(fēng)險(xiǎn)增加，且死亡風(fēng)險(xiǎn)高于非糖尿病患者[4~7]。有研究表明，二甲雙胍作為一種廣泛的抗糖尿病藥物，可以降低糖尿病患者的癌癥發(fā)病率[8]，并在動(dòng)物模型中抑制癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)[9~11]。二甲雙胍引起前列腺癌細(xì)胞周期G0~G1期阻滯，但并不會(huì)引起細(xì)胞凋亡或自噬[10]。在分子水平，二甲雙胍調(diào)節(jié)AMP依賴(lài)的蛋白激酶(AMPK)/mTOR通路[12]。mTOR可以促進(jìn)耗能的細(xì)胞進(jìn)程并控制細(xì)胞生長(zhǎng)。由于AMPK的激活抑制耗能通路和蛋白合成[13]，二甲雙胍可以通過(guò)AMPK來(lái)抑制細(xì)胞增殖。相反，若下調(diào)AMPK并不會(huì)影響二甲雙胍在前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和mTOR通路抑制中的作用[10]。

REDD1(RTP801/Dig2/ DDIT4)被認(rèn)為是低氧誘導(dǎo)因子1靶基因，參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)[14]。在缺氧環(huán)境下REDD1失活，細(xì)胞增殖增強(qiáng)，在一些腫瘤中REDD1下調(diào)[15]。REDD1是mTOR的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白[16]，在調(diào)節(jié)mTOR和線(xiàn)粒體活性，抑制腫瘤發(fā)生的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[17]，其與細(xì)胞凋亡有關(guān)[14]。有研究報(bào)道，二甲雙胍可以增加REDD1的表達(dá)。

本研究結(jié)果提示,二甲雙胍在體外可以抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，且抑制程度隨二甲雙胍濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而呈增強(qiáng)趨勢(shì)。二甲雙胍能明顯上調(diào)REDD1的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)mTOR的表達(dá)。提示二甲雙胍可能通過(guò)REDD1/mTOR信號(hào)通路抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。

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(收稿日期：2015-06-23)

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)01-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.009

通信作者：賴(lài)曉陽(yáng)(E-mail:laixyang60@sina.com)