梁現(xiàn)蕊，趙　萃

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

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韓信草化學(xué)成分分離與結(jié)構(gòu)鑒定

梁現(xiàn)蕊，趙萃

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：采用反相高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，從韓信草乙酸乙酯提取液中分離得到3個(gè)單體化合物，根據(jù)光譜數(shù)據(jù)鑒定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分別為5,8-二甲基-6,7-亞甲二氧基黃酮(Ⅰ)，5,7-二甲氧基黃酮(Ⅱ)，5,6,7,8-四甲氧基黃酮(Ⅲ)，該3個(gè)化合物均為首次從該植物中分離得到，其中化合物I為一個(gè)新的黃酮類化合物.該方法簡(jiǎn)單、高效，能快速獲得高純度的目標(biāo)化合物.

關(guān)鍵詞：韓信草；高效液相色譜；化學(xué)成分

韓信草(ScutellariaindicaL.)是唇形科(Labiatae)黃芩屬(Scutellaria)多年草本生植物.廣泛分布于中國，韓國，日本和東南亞國家.其全草可入藥，具有清熱解毒，活血止血，散郁消腫等功效，用作解毒劑，止痛劑和止血?jiǎng)﹣碇委熆妊獓I血，肝熱煩躁，肺熱喘咳，跌打腫痛，外傷出血，毒蛇咬傷等疾病[1].現(xiàn)代藥理學(xué)和治療學(xué)研究顯示，韓信草還具有抗病毒和治療心血管疾病的作用[2-3].

韓信草中主要活性成分為黃酮類化合物[1-2,4]，如芹菜素、木犀草、漢黃芩素和漢黃芩苷等.植物藥材化學(xué)成分復(fù)雜，傳統(tǒng)的分離純化方法，如大孔樹脂吸附法、薄層色譜法和柱層析法等，操作繁瑣且分離效率低.高效液相色譜法具有高效、快速和靈敏等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于分離純化多種化學(xué)成分[5-7].本實(shí)驗(yàn)使用半制備液相色譜從韓信草乙酸乙酯提取液中分離純化并鑒定了3個(gè)黃酮類化合物，分別為5,8-二甲基-6,7-亞甲二氧基黃酮(Ⅰ)，5,7-二甲氧基黃酮(Ⅱ)，5,6,7,8-四甲氧基黃酮(Ⅲ)，該3個(gè)化合物均為首次從該植物中分離得到，其中化合物I為一個(gè)新的黃酮類化合物.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(Agilent，美國)；Varian Mercury-Plus 400型核磁共振儀(Agilent Varian，美國)；Bruker micrOTOF四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Bruker，美國)；KH5200DE型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)公司)；翻轉(zhuǎn)式貝利粉碎機(jī)(濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司)；離心機(jī)(Thermo Scientific，美國)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi，瑞士)；Barnstead TⅡ超純水系統(tǒng)(Thermo Scientific，美國).

甲醇和乙腈(色譜純，TEDIA，美國)；CDCl3(99.8%D+0.03%TMS，青島騰龍微波科技有限公司)；其余本實(shí)驗(yàn)中用到的溶劑或試劑均為分析純，由天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；藥材韓信草產(chǎn)于河北省，樣品保存于浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院.

1.2　樣品提取

干燥的韓信草藥材經(jīng)貝利粉碎機(jī)粉碎后，過80目篩，取過篩后的韓信草樣品10 g，加入100 mL乙酸乙酯，靜置12 h后，25 ℃超聲30 min，離心，取上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，加3 mL甲醇溶解后，用0.22 μm PTFE濾膜過濾，用于半制備分離.

1.3　化學(xué)成分的分離制備

取上述樣品溶液，采用半制備高效液相色譜分離.色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×9.6 mm，5 μm)；柱溫：室溫；流速：2.8 mL/min；進(jìn)樣量：60 μL；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)=75∶25；檢測(cè)波長：270 nm；運(yùn)行時(shí)間：17 min.按照色譜峰的保留時(shí)間不同進(jìn)行分段收集，分別收集10.7～11.4 min，11.5～12.2 min，12.3～13.0 min三段組分(圖1)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑分別得到化合物Ⅰ(15.8 mg)，化合物Ⅱ(17.5 mg)，化合物Ⅲ(14.4 mg).

圖1　韓信草提取液的高效半制備液相色譜圖Fig.1　Semi-preparative high performance liquid chromatogram of S. indica extract

1.4　樣品純度分析條件及色譜峰純度評(píng)價(jià)

由1.3制備獲得的3個(gè)化合物進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜條件為色譜柱Waters AtlantisRR T3(150 mm×4.6 mm，3 μm)；柱溫：室溫；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)=55∶45；檢測(cè)波長：270 nm；分析時(shí)間：15 min.由面積歸一化法計(jì)算化合物的含量，同時(shí)進(jìn)行190～400 nm全波長掃描，檢查色譜峰各個(gè)位置的光譜，對(duì)色譜峰純度進(jìn)行評(píng)價(jià).

2結(jié)果

2.1　樣品純度檢測(cè)

使用高效液相色譜法對(duì)分離得到的3個(gè)化合物進(jìn)行純度測(cè)試，3個(gè)化合物色譜峰各點(diǎn)的光譜重疊，說明色譜峰的純度高.化合物含量由面積歸一化法計(jì)算，在270 nm檢測(cè)波長下，測(cè)得3個(gè)化合物的含量均大于97%，說明純度較高，見圖2.

2.2　結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)化合物Ⅰ～Ⅲ光譜數(shù)據(jù)(UV，MS，1H和13C NMR)，確定它們的結(jié)構(gòu)如圖3所示，其中化合物Ⅱ和Ⅲ與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致，化合物Ⅰ為新物質(zhì).UV和MS數(shù)據(jù)如表1所示，3個(gè)化合物的MS數(shù)據(jù)均為正離子模式下所測(cè)定的結(jié)果，利用分析軟件Bruker Daltonics DataAnalysis 4.0推測(cè)可能的分子式，其誤差絕對(duì)值小于5×10-6，說明數(shù)據(jù)可靠.

圖3　化合物Ⅰ～Ⅲ的結(jié)構(gòu)Fig.3　Structures of compounds Ⅰ-Ⅲ

化合物m/z測(cè)量值計(jì)算值誤差/10-6分子式λmax/nmⅠ327.0865327.0863-0.6C18H14O6276.0,315.5Ⅱ283.0966283.0965-0.3C17H14O4264.4,308.7Ⅲ343.1176343.11760.0C19H18O6270.5,306.8

化合物Ⅱ，白色粉末，1H NMR(CDCl3,400 MHz)：7.85(2H,m,H-2′,H-6′),7.48(3H,m,H-3′,H-4′,H-5′),6.68(1H,s,H-3),6.56(1H,d,J=2 Hz,H-8),6.36(1H,d,J=2 Hz,H-6),3.95(3H,s,7-OMe),3.91(3H,s,5-OMe),13C NMR：179.5(C-4),166.2(C-7),162.9(C-2),161.8(C-5),132.5(C-4′),132.2(C-l′),130.0(C-3′,5′),127.0(C-2′,6′),109.3(C-l0),108.7(C-3),97.3(C-6),94.1(C-8),56.5(MeO—at C-5,7).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物為：5,7-二甲氧基黃酮(5,7-dimethoxyflavone).

化合物Ⅲ，白色針狀晶體，1H NMR(CDCl3,400 MHz)：7.92(2H,m,H-2′,H-6′),7.49(3H,m,H-3′,H-4′,H-5′),6.69(1H,s,H-3),4.10(3H,s,7-OMe),4.02(3H,s,8-OMe),3.95(6H,s,5-OMe,6-OMe),13C NMR：177.1(C-4),160.9(C-2),151.3(C-7),148.2(C-9),147.6(C-5),144.0(C-6),138.0(C-8),131.5(C-l′),131.3(C-4′),128.9(C-3′,5′),125.9(C-2′,6′),114.9(C-l0),108.0(C-3),62.3,62.1,61.8,61.7(MeO—at C-5,6,7,8).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物為：5,6,7,8-四甲氧基黃酮(5,6,7,8-tetramethoxyflavone).

化合物Ⅰ，白色粉末，通過QTOF-MS可知分子式為C18H14O6，由UV和MS數(shù)據(jù)初步判定為黃酮類化合物，1H NMR(CDCl3,400 MHz)譜中，給出了兩甲氧基質(zhì)子信號(hào)δ:4.08(3H,s),4.04(3H,s),一個(gè)低場(chǎng)區(qū)亞甲基質(zhì)子信號(hào)δ:6.08(2H,s),其余低場(chǎng)區(qū)信號(hào)δ:7.89(2H,m),7.50(3H,m),6.68(1H,s)與化合物Ⅱ和Ⅲ相近，說明含有相似結(jié)構(gòu).結(jié)合DEPT譜，13C NMR(CDCl3,400 MHz)給出了16個(gè)碳信號(hào)，包括9個(gè)季碳信號(hào)δ:178.1,161.2,147.2,143.1,136.3,136.1,131.2,128.3,113.2；4個(gè)叔碳信號(hào)δ:131.4,128.9,126.0,107.7；1個(gè)仲碳信號(hào)δ:102.4；2個(gè)伯碳信號(hào)δ:61.5,61.2.其中δ:128.9,126.0為等性碳信號(hào)，即有6個(gè)叔碳.通過HSQC譜對(duì)化合物進(jìn)行了準(zhǔn)確的歸屬(表2).該化合物的1H NMR數(shù)據(jù)與3,5-dimethoxy-6,7-methylenedioxyflavone的數(shù)據(jù)[10]十分相近，但13C NMR卻有差異，通過HMBC和COSY譜確定，化合物中的甲氧基位于C-5位和C-8位.經(jīng)查閱文獻(xiàn)，該化合物為一個(gè)新的黃酮類化合物，命名為5,8-二甲基-6,7-亞甲二氧基黃酮(5,8-dimethoxy-6,7-methylenedioxyflavone).

表2　化合物Ⅰ的NMR數(shù)據(jù)

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用半制備高效液相色譜法快速、高效分離純化韓信草乙酸乙酯提取液中3個(gè)主要的化學(xué)成分，并通過MS，UV和NMR光譜數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu).這3個(gè)黃酮類化合物均為首次從該藥材中分離得到，其中化合物Ⅰ為一個(gè)新的黃酮類化合物.該方法具有簡(jiǎn)單、高效和快速等優(yōu)點(diǎn)，可用于植物藥化學(xué)成分的快速分析與鑒定，并為其他類似植物藥材中成分分離和純化鑒定提供了有利的參考，具有潛在的應(yīng)用前景.

參考文獻(xiàn)：

[1]MIYAICHI Y, IMOTO Y, TOMIMORI T, et al. Studies on the constituents ofScutellariaspecies. IX. On the flavonoid constituents of the root ofScutellariaindicaL.[J]. Chemical and pharmaceutical bulletin,1987,35(9):3720-3725.

[2]KIM S W, CUONG T D, HUNG T M, et al. Arginase Ⅱ inhibitory activity of flavonoid compounds fromScutellariaindica[J]. Archives of pharmacal research,2013,36:922-926.

[3]LI Y L, OOI L S M, WANG H, et al. Antiviral activities of medicinal herbs traditionally used in southern mainland China[J]. Phytotherapy research,2004,18:718-722.

[4]王玉寶．韓信草化學(xué)成分的研究[J]．安徽醫(yī)藥，2014，18(10)：1850-1851．

[5]張翠萍，李行諾，陳鴛誼，等．反相高效制備液相色譜法制備洋川芎內(nèi)酯H和I[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(4)：386-389．

[6]李行諾，翟文豐，周孟宇，等．黃柏化學(xué)成分研究[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40(3)：244-246．

[7]陳鴛誼，李行諾，張翠萍，等．當(dāng)歸中的一個(gè)新苯酚類化合物[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(5)：524-527．

[8]TOMAS-BARBERAN F A, MSONTHI J D, HOSTETTMANN K. Antifungal epicuticular methylated flavonoids from helichrysum nitens[J]. Phytochemistry,1988,27(3):753-755.

[9]付春燕，尹文清，周中留．瓜馥木化學(xué)成分研究[J]．廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，25(3)：72-74．

[10]BUSCHI C A, POMILIO A B, GROS E G. A new flavones fromGomphrenamartiana[J]. Phytochemistry,1979,18:1249-1250.

(責(zé)任編輯：陳石平)

Isolation and identification of the constituents fromScutellariaindicaL.

LIANG Xianrui, ZHAO Cui

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:Semi-preparative high performance liquid chromatography was applied to separate and purify three main compounds from the ethyl acetate extract of Scutellaria indica L.. Their structures were elucidated as 5,8-dimethoxy-6,7-methylenedioxyflavone (Ⅰ), 5,7-dimethoxyflavone (Ⅱ) and 5,6,7,8-tetramethoxyflavone (Ⅲ) by spectral analysis. The three compounds were isolated from the S. indica for the first time, and the compound I was a new compound. This method was simple, effective and reliable for a high purity of a target composition.

Keywords:Scutellaria indica L.; high performance liquid chromatography; chemical constituents

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2016)01-0088-04

作者簡(jiǎn)介：梁現(xiàn)蕊(1975—)，女，山東臨沂人，副教授，主要從事藥物結(jié)構(gòu)分析工作，E-mail: liangxrvicky@zjut.edu.cn.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21206148)

收稿日期：2015-04-16