吳　 娟，杜　 蕓*，王　 珩，吳家寧，趙銀環(huán)，王　 蕊，張　 艷，紀曉坤（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院癌檢中心，河北　 石家莊　 050011）

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非小細胞肺癌患者細胞學標本EGFR基因突變檢測及其臨床病理意義

吳 娟，杜 蕓*，王 珩，吳家寧，趙銀環(huán)，王 蕊，張 艷，紀曉坤
（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院癌檢中心，河北 石家莊 050011）

【摘要】目的： 探討細胞學標本在非小細胞肺癌(NSCLC)的診斷及個體化治療中的臨床應用價值。方法：收集352例新鮮細胞學標本制片后，行常規(guī)HE染色；同時選擇TTF-1、NapsinA、CK7、CEA、CD56、Syn、P63、CK5/6、WT-1、E-cadherin等抗體對來源不明的腫瘤細胞進行免疫細胞化學標記，并對明確診斷為NSCLC的病例，采用突變擴增阻滯系統(tǒng)(ARMS)檢測表皮生長因子受體(EGFR)基因突變情況。結果：352例患者中，345例有癌細胞。經(jīng)臨床及免疫細胞化學證實345例惡性細胞中，NSCLC有335例，且NSCLC細胞學標本中有302例DNA提取成功，占90.15%(302/335)。EGFR基因檢測結果顯示，EGFR共突變123例，總突變率為40.73%(123/302)。其中，第18、19、20、21外顯子的突變率分別為0.99%(3/302)、19.21%(58/302)、0.66%(2/302)和19.87% (60/302)；EGFR 18、19、21外顯子突變占EGFR突變總數(shù)的98.37%(121/123)顯著高于EGFR 20外顯子突變(P<0.05)。302例患者中，女性患者EGFR 突變率為54.35% (75/138)，明顯高于男性患者29.27%(48/164)(P<0.05)；非吸煙患者EGFR的突變率為51.49%(104/202)，顯著高于吸煙者19%(19/100)(P<0.05)。276例腺癌中EGFR突變率44.20%(122/276)；非腺癌EGFR突變率4.34%(1/23)；腺癌EGFR突變率明顯高于其他類型(P<0.05)。結論：利用新鮮細胞學標本，結合免疫細胞化學標記和ARMS分子病理技術有助于晚期非小細胞肺癌的診斷，并為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)個體化治療提供可靠依據(jù)。

【關鍵詞】細胞學標本；免疫細胞化學；非小細胞肺癌；突變擴增阻滯系統(tǒng)；EGFR基因突變檢測

作者信息： 吳 娟，E-mail：wujuan199012@163.com。*通信作者，杜 蕓 ，Tel：0311-86095393，E-mail：yydd40@126.com

Detection of EGFR gene mutation in non-small cell lung cancer and its clinical significance

WU Juan，DU Yun*， WANG Heng，WU Jianing，ZHAO Yinhuan，WANG Rui，ZHANG Yan，JI Xiaokun
(Cancer Detection Center of the Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the clinical value of cytological specimens in the diagnosis and the individualized treatment of non-small cell lung cancer(NSCLC). METHODS：Cytological specimens were stained with HE and with immunocytochemical method to detect expression of an appropriate set of antibodies (TTF-1，NapsinA，CK7，CEA，CD56，Syn，P63，CK5/6，WT-1，E-cadherin)，in tumor cells of unknown origin. The epidermal growth factor receptor(EGFR) gene was detected by the amplification refractory mutation system(ARMS) in NSCLC. RESULTS：In 352 patients，345 cases were found cancer cells on the cytological specimens．According to the clinical history and immunocytochemical staining of the 345 malignant cases，335 were NSCLC cytological samples，and the DNA of 302 NSCLC samples were extracted successfully (satisfaction rate at 90.15%). EGFR mutations were detected in 123 of the 302 specimens (40.73%，123/302) and the frequencies of EGFR mutations in exon18，19，20(T790M)，21 were 0.99% (3/302)， 19.21%(58/302)，0.66%(2/302) and 19.87% (60/302)，respectively. Higher frequencies of EGFR mutations were detected in exons 18，19 and 21(98.37%，121/123) than in exon 20(P<0.05). EGFR mutations were more frequently detected in women(54.35%，75/138) than in men (29.27%，48/164)(P<0.05)，and in non-smokers (51.49%，104/202) than in smokers 19%(19/100)(P<0.05). Mutations were identified in 44.20%(122/276) cases of adenocarcinoma and 4.34%(1/23) in nonadenocarcinoma. Mutation of EGFR gene in adenocarcinoma was higher than thatin non-adenocarcinoma(P<0.05). CONCLUSION：The use of cytological specimens in combination with immunocytochemical staining and molecular techniques helps in the diagnosis of advanced cancer and individualized treatment option of NSCLC.

【KEY WORDS】cytological specimens；immunocytochemical；non-small cell lung cancer；amplification refractory mutation system；EGFR gene mutation detection

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤。目前非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的分子靶向治療成為了研究熱點，以易瑞沙(Iressa)為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosinase inhibitor，EGFR-TKI)在NSCLC的治療中取得了很好的療效[1]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變率在肺腺癌患者明顯高于其他病理類型肺癌患者，并且EGFR基因第18～21外顯子突變情況與EGFR-TKIs藥物的療效有關[2]。因此，2012 年的NCCN指南中明確提出NSCLC個體化治療的重要性，指南提出首先必須明確NSCLC的病理學類型，然后再進行EGFR基因檢測，并對EGFR基因突變的晚期肺癌患者首選酪氨酸激酶抑制劑治療；對于無突變患者，則行常規(guī)治療。因此，準確檢測患者EGFR基因的突變狀態(tài)，有助于篩選出適合EGFR-TKIs治療的人群，指導臨床個體化治療以及降低患者的經(jīng)濟負擔。目前，EGFR基因突變檢測仍以石蠟組織學標本檢查為主，但是70%以上的肺癌患者在確診時已成為III～IV期，大部分已失去手術機會，腫瘤組織難以獲取。胸水、心包積液、頸部及鎖骨上淋巴結細針穿刺活檢、支氣管刷片以及CT下肺穿刺涂片等細胞學檢查方法是肺癌晚期無法手術患者的主要診斷途徑。本研究旨在探討利用胸水、心包積液、細針穿刺活檢、纖維支氣管鏡刷片等微創(chuàng)的方法獲得的新鮮細胞學標本，結合免疫細胞化學標記和突變擴增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)分子病理技術對晚期非小細胞肺癌作出明確診斷后再進行EGFR基因檢測，為EGFR-TKIs個體化治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院2013年12月—2015年1月新鮮細胞學標本352例，其中男性184例，女性168例，年齡28～85歲，平均年齡56.5歲。送檢標本中，胸腔積液168例，心包積液2例，頸部及鎖骨上淋巴結細針穿刺115例，支氣管鏡刷片1例，CT引導下肺穿刺活檢標本66例。

1.2 細胞涂片的制備

1.2.1 體液標本 送檢體液標本用膜式細胞采集器(濾膜孔徑8～12 μm)過濾50～100 mL，打開細胞采集器，用無菌鑷子取出過濾膜，將膜片上截留的細胞均勻的涂在載玻片上，2張涂片用于常規(guī)HE染色，預留8張免疫細胞化學涂片，剩余標本放入20 mL離心管內(nèi)，2 000 r/min離心5 min，以沉淀物多少決定是否將剩余液體全部離心。最后一次離心完畢留取約5 mL上清液，將離心管內(nèi)的細胞沉淀吹打混勻成細胞懸液，-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 頸部及鎖骨上淋巴結細針穿刺及CT引導下肺穿刺活檢標本 常規(guī)HE涂片及預留免疫細胞化學涂片后，將穿刺針內(nèi)剩余標本放入1.5 mL無菌EP管內(nèi)，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 支氣管鏡刷片標本 任意選取兩張刷片標本行常規(guī)HE染色，其余標本-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

以上標本涂片均經(jīng)95%酒精固定5 min后行常規(guī)HE染色，對涂片中找到癌細胞的病例再進行免疫細胞化學分型及后續(xù)的分子病理檢測。

1.3 免疫細胞化學

采用SP法進行免疫細胞化學染色。根據(jù)病人的臨床資料及顯微鏡下HE染色細胞學形態(tài)選擇相應抗體，常規(guī)選擇TTF-1、NapsinA、CK7、CEA、CD56、Syn、P63、CK5/6、WT-1、E-cadherin等抗體對來源不明的腫瘤細胞進行免疫細胞化學標記。所用抗體均購自福州邁新生物技術有限公司。常規(guī)設置陽性及陰性對照。免疫細胞化學染色步驟：首先將預留的細胞涂片于95%酒精固定15 min，風干，蒸餾水水洗；再置于3%過氧化氫溶液中15 min，蒸餾水水洗；高壓抗原修復1.5 min后PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；然后滴加動物非免疫血清封閉非特異性抗原，室溫孵育20 min；棄去多余血清后滴加一抗，放置濕盒內(nèi)4 ℃過夜；PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；棄去多余水分，滴加二抗，室溫孵育20 min后PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；最后DAB顯色3 min，蘇木素復染細胞核。

1.4 EGFR基因突變檢測

1.4.1 新鮮細胞學標本DNA的提取 釆用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH，德國)試劑盒提取新鮮細胞學標本DNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。將收集好的DNA在紫外分光光度計下進行DNA濃度及純度的檢測，確保DNA的濃度在5～1 500 ng/μL，DNA D(260)/D(280)值在1.8～2.0之間，4 ℃或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 EGFR基因突變檢測 對經(jīng)免疫細胞化學及臨床資料證實為NSCLC的病例，采用上海源奇公司研發(fā)的人類EGFR基因突變檢測試劑盒(ARMS法)進行實時熒光定量PCR，檢測EGFR基因18～21號外顯子的突變。具體操作步驟按試劑盒說明書進行，反應體系為25 μL，40個循環(huán)，在ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行，每次上機檢測均設置一個陽性對照和一個陰性對照。根據(jù)試劑盒說明書上結果判定標準對PCR反應擴增曲線及CT值 進行分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，采用四格列聯(lián)表χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析，當理論頻數(shù)小于5或總觀測頻數(shù)小于30時，用Fisher的概率檢驗法。以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 細胞涂片質量控制

在選取的352例患者中經(jīng)兩位有經(jīng)驗的細胞學病理醫(yī)師診斷，判讀結果345例為找到癌細胞的病例，并且細胞涂片中癌細胞的數(shù)量占整個涂片細胞數(shù)量的25%以上(每張涂片上癌細胞的數(shù)量≥200個)。

2.2 免疫細胞化學分型

345例經(jīng)判讀為找到癌細胞的細胞學標本均行免疫細胞化學染色，結合免疫細胞化學染色結果提示及臨床其他輔助檢查證實，肺腺癌303例，肺鱗狀細胞癌32例，肺小細胞癌2例，乳腺癌1例；7例起源不明，免疫細胞化學無特異性表達(圖1)。

A：膜式細胞采集器胸水細胞涂片(肺腺癌，腺癌細胞保留完整微小乳頭狀結構，HE染色)；B：肺腺癌細胞CEA呈強陽性，細胞質呈棕黃色(SP 法)；C：肺腺癌細胞CK7呈強陽性，細胞質呈棕黃色(SP法)；D：肺腺癌細胞E-cadherin呈強陽性，細胞膜呈棕黃色(SP法)；E：肺腺癌細胞NapsinA呈強陽性，細胞質呈棕黃色顆粒狀(SP法)；F：肺腺癌細胞TTF-1呈強陽性，細胞核呈棕黃色(SP法).圖1 免疫細胞化學染色(×200)

2.3 標本DNA提取及質量控制

將篩選出的335例NSCLC的病例進行新鮮細胞學標本DNA提取，其中有302例標本DNA提取成功，占90.15%。將提取的DNA在紫外分光光度計下進行DNA濃度及純度的檢測，結果本研究中所提取DNA的濃度及純度均在質控范圍內(nèi)。

2.4 EGFR基因突變情況

2.4.1 EGFR基因突變率及突變類型 302例新鮮細胞學標本EGFR基因檢測結果顯示，EGFR共突變123例，總突變率為40.73%(123/302)。其中，第18外顯子突變率為0.99%(3/302)；第19外顯子突變率為19.21% (58/302)；第20外顯子T790M突變率為0.66%(2/302)；第21外顯子突變率為19.87%(60/302)；EGFR 18、19、21外顯子突變占EGFR突變總數(shù)的98.37%(121/123)，顯著高于EGFR 20外顯子突變(P<0.05)。

2.4.2 EGFR基因突變與臨床病理特征的關系 302例患者中，女性患者EGFR突變率為54.35%(75/138)，明顯高于男性患者29.27%(48/164)(P<0.05)。在病人是否吸煙的因素中分析發(fā)現(xiàn)，非吸煙患者EGFR的突變率為51.49%(104/202)，顯著高于吸煙患者19%(19/100) (P<0.05)。隨訪截至到2015年1月，所有標本經(jīng)免疫細胞化學及臨床其他輔助檢查證實，其中腺癌276例，EGFR基因突變率44.20%(122/276)；非腺癌23例，EGFR基因突變率4.34%(1/23)。EGFR基因突變與臨床病理特征的關系見表1。

表1 EGFR基因突變與臨床病理特征的關系

3 討 論

在NSCLC的治療上，以易瑞沙為代表的EGFRTKI因其療效顯著和作用明顯而引起廣泛重視[1]。大量研究結果顯示，EGFR基因突變是決定EGFR-TKIs療效的最重要預測因子，而EGFR突變的優(yōu)勢人群是亞裔、女性、無吸煙史的腺癌患者[2]。通過這種優(yōu)勢人群的篩選可使EGFR-TKIs藥物的療效提高到70%以上。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC的人群選擇性與表皮生長因子受體酪氨酸激酶區(qū)域的基因突變有關[3]。不同位點突變的生物學功能有所不同，例如，EGFR 18、 19、21外顯子突變的NSCLC對 EGFR-TKIs具有良好的療效，而20外顯子中T790M突變時是形成EGFRTKIs繼發(fā)性耐藥的重要機制之一[4]。近期，易瑞沙已進入NSCLC的一線治療，在采用易瑞沙治療前應先檢測EGFR基因的突變狀況[5]。因此，如何快速準確地檢測出EGFR基因的突變狀況，成為病理學工作者協(xié)助臨床醫(yī)生進行治療的一項重要任務。

大多數(shù)NSCLC患者在初次就診時即為晚期，無法通過手術方式獲取組織學標本。本研究中我們選取胸腔積液、心包積液、頸部及鎖骨上淺表淋巴結細針穿刺、CT引導下肺穿刺小活檢標本及纖維支氣管鏡刷片幾種常見的細胞學標本作為研究對象。而獲取這些標本具有操作風險小，細胞病理學診斷準確率高、可重復性強等特點。我們提取302例新鮮細胞學標本的DNA，成功率為90.15% (302/335)，DNA濃度均在5～1 500 ng/μL，D(260)/D(280)值均在1.8～2.0之間。比石蠟包埋組織提取的DNA滿意率高。原因可能是從石蠟包埋的組織塊中提取DNA，腫瘤細胞經(jīng)過福爾馬林固定、無水乙醇脫水、包埋等多種理化因素刺激后，使腫瘤細胞的DNA片段化嚴重進而影響到基因檢測結果。而新鮮細胞學標本，DNA結構能夠保存完好，所以使EGFR基因檢測結果更為準確、可靠。

ARMS法具有較高的敏感度，同時操作簡單，質量控制體系完善，具有廣泛的臨床應用價值。本研究采用ARMS法商品化試劑盒檢測302例NSCLC患者新鮮細胞學標本中EGFR基因突變狀態(tài)，檢測結果顯示，EGFR總突變率為40.73%(123/302)。其中，第18外顯子突變率為0.99%(3/302)；第19外顯子缺失突變率為19.21% (58/302)；第20外顯子T790M突變率為0.66% (2/302)；第21外顯子突變率為19.87%(60/302)；EGFR 18、19、21外顯子突變占EGFR突變總數(shù)的98.37% (121/123)顯著高于EGFR 20外顯子突變(P<0.05)。與已經(jīng)報道的亞洲大型臨床研究Lee等[6]的研究結果相近。本研究302例患者中，女性患者EGFR突變率為54.35% (75/138)，明顯高于男性患者29.27% (48/164)(P<0.05)。在病人是否吸煙的因素中分析發(fā)現(xiàn)，非吸煙者EGFR的突變率為51.49%(104/202)，顯著高于吸煙者19% (19/100)(P<0.05)。隨訪截至到2015年1月，所有標本經(jīng)免疫細胞化學及臨床其他輔助檢查證實，其中腺癌276例，EGFR基因突變率44.20% (122/276)；非腺癌23例，EGFR基因突變率4.34% (1/23)；肉瘤樣癌2例，癌肉瘤1例均未發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變。胸腔積液標本EGFR基因的突變率為49.32%， 明顯高于其他標本類型；Ⅲ～Ⅳ期病人EGFR基因的突變率為43.18%，明顯高于I～II病人。與文獻報道女性、不吸煙和腺癌患者EGFR基因突變率高于男性、吸煙和非腺癌患者的結果相一致[7]。

應用分子靶向藥物前應首先進行EGFR基因突變檢測，使用小活檢切除標本或者手術后石蠟包埋切片標本的EGFR檢測結果已經(jīng)有文獻報道[8-10]。胸腔積液石蠟包埋細胞塊標本，以及粗針穿刺獲取標本制成石蠟包埋塊檢測EGFR的基因突變在國內(nèi)也有報道[11-13]。當今臨床提倡腫瘤患者診斷和治療應該采取損傷小，患者痛苦少的方法。尤其對于一些就診時已經(jīng)是晚期，出現(xiàn)胸腔積液或淋巴結轉移的患者，我們應用新鮮細胞學標本做出診斷后，剩余的細胞標本進行DNA提取，進而行EGFR基因檢測，國內(nèi)尚未見報道。對于晚期肺癌患者，細胞學標本取材容易，創(chuàng)傷小，是其重要的標本來源。本研究應用新鮮細胞學標本，聯(lián)合免疫細胞化學標記明確診斷為NSCLC后采用ARMS法進行EGFR基因檢測，陽性率與手術切除組織標本相似。本實驗室的方法首先可以明確細胞學標本中是否有癌細胞，其次可以了解癌細胞量是否滿足要求，因此結果更為準確、可靠。應用新鮮細胞學標本進行EGFR基因檢測將有助于篩選出應用靶向藥物治療受益的NSCLC人群，為更加精確、合理的為EGFRTKIs個體化治療提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1] Mok TS，Wu YL，Thongprasert S，et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J]. N Engl J Med，2009，361(10)：947-957.

[2] Govindan R. Proceedings from the 10th annual meeting of molecularly targeted therapy in non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol，2010，5(Sup 6) ：433-496.

[3] Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J]. N Engl J Med，2004，350( 21) ：2129-2139．

[4] 劉 標，周曉軍. 非小細胞肺癌個體化治療的靶向分子檢測[J]. 臨 床與實驗病理學雜志，2012，28(8)：831-837．

[5] Nagai Y，Miyazawa H，Hu Q，et al．Genetic heterogeneity of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer cell lines revealed by a rapid and sensitive detection system，the peptide nucleic acid-locked nucleic acid PCR clamp[J]．Cancer Res，2005，65(16) ：7276-7282.

[6] Lee JS，Park K，Kim SW，et al. A randomized phase III study of gefitinib versus standard chemotherapy (gemcitabine plus cisplatin) as a first-line treatment for never smokers with advanced or metastatic adenocarcinoma of the lung[R]. San Francisco：13thWorld Conference on Lung Cance，2009：4.

[7] Tokumo M，Toyooka S，Kiura K，et al. The relationship between epidermal growth factor receptor mutations and clinicopathologic features in non-small cell lung cancers[J]. Clin Cancer Res，2005，11(3)：1167-1173.

[8] Ohba T，Toyokawa G，Kometani T，et al. The mutations of the EGFR and K-RAS genes in resected stage I lung adenocarcinoma and their clinical significance[J]. Surg Today， 2014，44(3)：478-486.

[9] Baykara O，Tansarikaya M，Demirkaya A，et al. Association of epidermal growth factor receptor and K-RAS mutations with smoking history in non-small cell lung cancer patients[J]. Exp Ther Med，2013，5(2)：495-498.

[10] de Mello RA，Marques DS，Medeiros R，et al. Epidermal growth factor receptor and K-RAS in non-small cell lung cancer-molecular pathways involved and targeted therapies[J]. World J Clin Oncol，2011，2(11)：367-376.

[11] 孟加榕，郭以河，張閩峰，等. 肺癌胸水細胞塊與組織學EGFR基因擴增檢測對比研究[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2012，20(9)：1830-1833.

[12] 王 征，武曉楠，穆新林，等. 非小細胞肺癌胸水中癌細胞EGFR基因TK區(qū)突變研究[J]. 心肺血管雜志，2009，28(2)：112-116.

[13] 王海彥，莊一平，張 晉，等. CT引導下經(jīng)皮細針穿刺活檢檢測中晚期肺癌表皮生長因子受體基因突變[J]. 中國介入影像與治療學，2013，10(1)：33-36.

基金項目：河北省科技廳項目(14277782D)

收稿日期：2015-06-01；

修訂日期：2015-10-28

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0027-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.006