陳建國(guó)，張露，李雪，李金霞，譚望橋，程池，*（.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京0005；.海南諾尼生物工程開(kāi)發(fā)有限公司，海南海口5705）

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HPLC法測(cè)定諾尼果汁中兩種環(huán)烯醚萜類成分的含量

陳建國(guó)1，張露1，李雪1，李金霞1，譚望橋2，程池1，*
（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京100015；2.海南諾尼生物工程開(kāi)發(fā)有限公司，海南?？?70125）

摘要：建立了一種高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定諾尼果汁中車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量的方法。采用Shimpack VP-ODS-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，乙腈-磷酸水溶液為流動(dòng)相，流速為0.5min/mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm。在此條件下，車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸分離良好，濃度分別在5 μg/mL~50 μg/mL和25 μg/mL~250 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.02 %和102.15 %，RSD值為1.58 %和2.40 %。西沙諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸平均含量為0.204 mg/mL和1.640mg/mL。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；西沙諾尼；諾尼果汁；環(huán)烯醚萜；車葉草苷酸；去乙酰車葉草苷酸

諾尼（Noni），學(xué)名海巴戟天（Morinda citrifolia Linn.），原產(chǎn)于一些太平洋島嶼、東南亞和澳大利亞等地，現(xiàn)引種于我國(guó)海南省。諾尼有廣泛的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，富含大量活性成分如多糖、酚類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類和甾體類等，具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、降血脂和保護(hù)心血管等功能，對(duì)多種疾病有預(yù)防和治療作用[1-4]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道諾尼果含有兩種主要的環(huán)烯醚萜類活性物質(zhì)：車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗畸變等活性[5-10]。本文首次建立了同時(shí)測(cè)定諾尼果汁中車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量的方法，能為諾尼果汁生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量的控制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀（VWD-3000紫外檢測(cè)器，Chromeleon 7色譜工作站）：Thermo Fisher公司；minispin離心機(jī)：eppendorf公司。

1.2試劑與材料

對(duì)照品車葉草苷酸（批號(hào)：130711）：購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司（質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.0 %）；去乙酰車葉草苷酸（批號(hào)：13042009）：購(gòu)自北京盛世康普化工技術(shù)研究院（質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.0 %）；乙腈、磷酸均為色譜純。西沙諾尼果汁：由海南諾尼生物工程開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)為20120911、20130618、20131206和20140122。

1.3方法

1.3.1色譜條件

檢測(cè)器：Thermo VWD-3000；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A液0.1 %磷酸溶液；B液乙腈；梯度洗脫：0 min~10 min，4 % B；10 min~22 min，15 %B；22 min~40 min，4 %B；流速：0.5 mL/min。在上述色譜條件下，取對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。理論塔板數(shù)按去乙酰車葉草苷酸計(jì)算不低于10 000，按車葉草苷酸計(jì)算不低于10 000。

1.3.2對(duì)照品溶液制備

稱取車葉草苷酸對(duì)照品5 mg，去乙酰車葉草苷酸對(duì)照品25 mg，置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/mL和2.5 mg/mL）。

1.3.3樣品溶液的制備

取20 mL西沙諾尼果汁10 000 r/min離心5 min，吸取上清液10 mL于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm膜。

2結(jié)果與分析

2.1色譜分離條件的選擇

車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸水溶液均在237 nm附近有最大吸收[11]，且在此波長(zhǎng)處，干擾組分對(duì)測(cè)定無(wú)影響，因此本實(shí)驗(yàn)選擇237 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。綜合考慮測(cè)定組分的分離度、峰對(duì)稱性及柱效等因素，最終選定乙腈-磷酸水溶液作為流動(dòng)相，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行梯度分離。最終選定采用流動(dòng)相：A液0.1 %磷酸溶液；B液乙腈；梯度洗脫：0 min~10 min，4 % B；10 min~ 22 min，15 %B；22 min~40 min，4 %B進(jìn)行測(cè)定。如圖1所示，被測(cè)組分與干擾成分之間能達(dá)到完全分離，柱效高，組分保留時(shí)間合適。

圖1對(duì)照品（A）和西沙諾尼果汁（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard solution and sample solution

2.2線性關(guān)系考察

吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀中，以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸：

車葉草苷酸：y=4.405x+0.139，R2=0.999 7，線性范圍為5 μg/mL~50 μg/mL。

去乙酰車葉草苷酸：y=5.030x+0.578，R2=0.999 8，線性范圍為25 μg/mL~250 μg/mL。

2.3精密度試驗(yàn)

取西沙諾尼果汁（批號(hào)20131206）一份，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸質(zhì)量濃度，如表1所示。

表1精密度測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of precision test

其RSD值分別為0.44 %和0.31 %。

2.4重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批西沙諾尼果汁（批號(hào)20131206）6份，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸質(zhì)量濃度，如表2所示，其RSD值分別為1.28 %和0.79 %。

表2重現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of repeatability test

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取西沙諾尼果汁（批號(hào)20131206）室溫放置，分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，記錄車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸質(zhì)量濃度，其RSD值分別為1.57 %和0.78 %，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定（表3）。

表3穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of stability test

2.6回收率試驗(yàn)

吸取同一批號(hào)西沙諾尼果汁（批號(hào)20131206）6份，每份1 mL，分別加入車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法計(jì)算車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸加樣回收率。車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸平均回收率及RSD值分別為99.02 %和1.58 %、102.15 %和2.40 %（表4）。

2.7樣品測(cè)定

取不同批次西沙諾尼果汁，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸質(zhì)量濃度，結(jié)果如表5所示。

表4回收率測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of recovery test

表5西沙諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸測(cè)定結(jié)果Table 5 Contents of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid in Xisha noni juice

2.8不同產(chǎn)地諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量比較

對(duì)不同產(chǎn)地諾麗果汁中車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量進(jìn)行了測(cè)定，從表6中可以看出，我國(guó)西沙諾尼果汁去乙酰車葉草苷酸含量最高，而車葉草苷酸含量與泰國(guó)相當(dāng)，但明顯高于大溪地、庫(kù)克和大西洋等產(chǎn)地。

表6不同產(chǎn)地諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量Table 6 Contents of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid in Tahiti noni juice

3　結(jié)論

本文綜合考慮車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸的分離度、峰對(duì)稱性及柱效等因素，最終采用Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-磷酸水溶液為流動(dòng)相，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行梯度分離，流速為0.5 mL/min，VWD-3000紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm。被測(cè)組分與干擾成分之間能達(dá)到完全分離，柱效高，組分保留時(shí)間合適，且本法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量。

應(yīng)用本文建立的HPLC方法，對(duì)四批次西沙諾尼果汁進(jìn)行了測(cè)定，西沙諾尼果汁去乙酰車葉草苷酸的含量較高，平均值為1.640 mg/mL，車葉草苷酸含量相對(duì)較低，平均值為0.204 mg/mL。車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸是植物代謝產(chǎn)生的環(huán)烯醚萜類活性物質(zhì)，這類物質(zhì)在酸性介質(zhì)和高溫條件下不穩(wěn)定，置于塑料容器中也易發(fā)生變化，但對(duì)光并不敏感[13]。不同批次西沙諾尼果汁車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸含量有所差異，可能與諾尼果成熟度、采集期、發(fā)酵工藝、滅菌方式和儲(chǔ)藏方法等因素有關(guān)。

車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸是2種環(huán)烯醚萜類活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗畸變等活性。本研究首次建立了同時(shí)測(cè)定諾尼果汁中這兩種活性物質(zhì)含量的HPLC方法，發(fā)現(xiàn)西沙諾尼果汁含有豐富的車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸，明顯高于大溪地、泰國(guó)、庫(kù)克和大西洋等產(chǎn)地。這兩種物質(zhì)可作為標(biāo)志性成分，應(yīng)用到諾尼果汁生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。

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Simultaneous Determination of Two Types of Iridoid Compounds in Noni Juice by HPLC

CHEN Jian-guo1，ZHANG Lu1，LI Xue1，LI Jin-xia1，TAN Wang-qiao2，CHENG Chi1，*
（1. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015，China；2. Hainan Noni Biological Engineering Development Co. Ltd.，Haikou 570125，Hainan，China）

Abstract：An analytical method of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid in Noni Juice was established by HPLC. The separation was performed on a Shim-pack VP-ODS C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with Acetonitrile-phosphoric acid aqueous as mobile phase at flow rate of 0.5 mL/min and detection wave length at 237 nm. Asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid were successfully separated.The calibration curve of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid were linear in the concentration range of 5 μg/mL-50 μg/mL and 25 μg/mL-250 μg/mL，respectively. The average recoveries of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid were 99.02 % and 102.15 %，respectively. The RSD of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid were 1.58 % and 2.40 %，respectively. The mean content of asperulosidic acid and deacetylasperulosidic acid in Xisha Noni juice were 0.204 mg/mL and 1.640 mg/mL.

Key words：HPLC；Xisha Noni；Noni juice；iridoid compounds；asperulosidic acid；deacetylasperulosidic acid

收稿日期：2014-09-23

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.035

*通信作者：程池，教授級(jí)高工。

作者簡(jiǎn)介：陳建國(guó)（1980—），男（漢），工程師，博士，從事保健原材的功效物質(zhì)及其作用機(jī)制研究。

基金項(xiàng)目：中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金（博士基金）項(xiàng)目（KJ14-BS-02）