潘在軒，陳敏

(瓊海市人民醫(yī)院病理科，海南 瓊海 571400)

HPV18型與早期子宮頸腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

潘在軒，陳敏

(瓊海市人民醫(yī)院病理科，海南 瓊海 571400)

目的 探討人乳頭狀瘤病毒(HPV)18型與早期子宮頸腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。方法 選取2000年1月至2011年1月瓊海市人民醫(yī)院收治的110例子宮頸腺癌患者作為研究對(duì)象，采用PCR法進(jìn)行HPV基因型檢測(cè)，比較HPV18型感染與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 110例宮頸腺癌患者中HPV 18型陽性者66例，占60.00%。HPV 18型陽性者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(27.27%)、脈管瘤栓率(24.24%)明顯高于陰性者(6.82%，4.85%，P＜0.05)。HPV 18型陽性患者與陰性患者的5年無瘤生存率(86.36%vs 86.36%)、5年總生存率(87.88%vs 90.91%)、無瘤生存時(shí)間[(63.54± 10.54)個(gè)月vs(65.01±12.41)個(gè)月]、總生存時(shí)間[(73.87±12.66)個(gè)月vs(75.11±13.68)個(gè)月]比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 HPV18型感染與早期子宮頸腺癌患者的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其與患者的總生存時(shí)間、無瘤生存時(shí)間無明顯相關(guān)性。

子宮頸腺癌；HPV基因型；預(yù)后；相關(guān)性

人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)基因型與生殖道惡性腫瘤密切相關(guān)，其中HPV 18型感染是子宮頸癌發(fā)病的重要因素[1]。近年來，關(guān)于子宮頸腺癌預(yù)后影響因素的研究越來越多，多數(shù)研究都認(rèn)為子宮頸腺癌的發(fā)生及預(yù)后均與HPV 18型密切相關(guān)，但近期也有學(xué)者提出HPV基因型與子宮腺癌預(yù)后并無關(guān)系[2]。本研究旨在明確HPV18型感染與子宮頸腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院在2000年1月至2011年1月期間收治的110例子宮頸腺癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診為子宮頸腺癌；FIGO (國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟)分期Ⅰ～Ⅱ期，且病理資料完整；行宮頸癌根治術(shù)進(jìn)行治療；無其他腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理資料不完整者；宮頸原位癌者；活檢標(biāo)本、蠟塊受損或被污染者；蠟塊組織過小或無腫瘤組織者。本組患者年齡26～71歲，平均(46.5±4.7)歲，孕次0～8次，平均(3.9±1.2)次。腫瘤類型：宮頸普通型腺癌50例，黏液性腺癌9例，腺鱗癌30例，子宮內(nèi)膜樣腺癌8例，漿液性腺癌4例，透明細(xì)胞癌4例，神經(jīng)內(nèi)分泌腺癌5例。所有患者均取腫瘤組織做HPV基因型檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器 石蠟組織DNA提取試劑盒(購自北京百泰克生物技術(shù)公司)、POWER PAC 200型電泳儀(購自美國Bio-Rad公司)、高速離心機(jī)(購自德國Eppendorf公司)、640-紫外分光光度儀(購自Beckman公司)、微量移液器(購自德國Eppendorf公司)、PCR引物設(shè)計(jì)(杭州浩基生物公司)、PCR引物合成(上海生工生物技術(shù)公司)。1.5%瓊漿糖凝膠由0.3 g瓊脂糖+20 mL TAE緩沖液配制而成。第一輪HPV18引物序列：正向5'-CACAGTTATGCACAGAGCTGC3'；反向5'-TATATTCATGCAATGTAGGTGTA3-'；第二輪HPV18引物序列：正向5'-CACTTCACTGCAAGACATAGA3-'；反向5-'GTTGTGAAATCGTCGTTTTTC A3-'。

1.3 HPV基因型檢測(cè)方法

1.3.1 DNA提取 將石蠟組織切片(厚5 μm)，放入離心管(組織量≥20 mg)，加入二甲苯1 mL，離心后去除上層清液。加入無水乙醇離心5 min，去除上層清液。晾干加入磷酸鹽緩沖液(PBS 200 μL)和溶液A (30 μL)，振蕩，孵育0.5～1 h(65℃)，直至溶液變得澄清，再孵育1 h(90℃)。冷卻至室溫后加入結(jié)合液200 μL和異丙醇100 μL，顛倒混勻，轉(zhuǎn)移到吸附柱中，離心后倒掉廢液。加入抑制物去除液IR(500 μL)，離心30 s去除廢液，再加入漂洗液WB(700 μL)，離心30 s去除廢液。將吸附柱放置到空的收集管內(nèi)，離心2 min去除漂洗液，再將吸附柱取出放置到離心管中，加入洗脫緩沖液50 μL，離心1 min。把離心后的溶液倒入吸附柱中，離心1 min，放置在2℃～8℃的環(huán)境中備檢。

1.3.2 DNA質(zhì)量檢測(cè) 使用分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液在260 nm和280 nm下的OD值，測(cè)定的OD260/OD280值在1.8～2.0之間，說明DNA純度較高，可用于HPV檢測(cè)。

1.3.3 HPV檢測(cè) ①巢式PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。第一輪：使用引物HPVX-Reverse、HPVX-Forward (HPVX為HPV基因型，X代表68、59、58、56、52、51、45、39、35、33、31、18、16)。94℃反應(yīng)2 min，94℃反應(yīng)30 s+ 58℃反應(yīng)30 s+68℃反應(yīng)30 s為一個(gè)循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)。第二輪：將上一輪獲得的PCR產(chǎn)物作為反應(yīng)模板，選用HPVX-R反向引物、HPVX-F正向引物做巢式PCR檢測(cè)。94℃反應(yīng)2 min，94℃反應(yīng)30 s+55℃反應(yīng)45 s+68℃反應(yīng)30 s為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)。②電泳。108 g Tris+55 g硼酸+40 mL EDTA(0.5 mmol/L)配置成1 L的10倍TBE緩沖液。將溴乙錠加入瓊脂糖凝膠溶液中，放置30 min使其凝固，然后放置到電泳槽中。在電泳槽中導(dǎo)入0.5倍TBE緩沖液直至液面超過凝膠面2 mm。量取8 μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物和2 μL的緩沖液，混合后加入樣孔，并加入DNA標(biāo)記作為參照。將電泳儀電壓設(shè)置為100 V進(jìn)行電泳，待溴化乙錠染色后，在紫外分光光度儀下觀察。電泳后，將凝膠去除，放置在圖像分析系統(tǒng)中觀察，通過比較已知DNA的堿基對(duì)長度來判定HPV基因型。

1.4 觀察指標(biāo) 收集所有患者的腫瘤最大徑線、病理分化程度、臨床分期、脈管內(nèi)瘤栓、宮旁浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料。電話隨訪至2016年3月，記錄患者的總生存時(shí)間(術(shù)日至末次隨訪時(shí)間/死亡時(shí)間)、無瘤生存時(shí)間(術(shù)日至復(fù)發(fā)時(shí)間)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV18型感染與病理特征的關(guān)系 本組110例宮頸腺癌患者中，HPV 18型陽性66例(60.00%)，從表1可知，HPV 18型陽性患者與陰性患者的FIGO分期、宮旁浸潤情況比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而HPV 18型陽性者的淋巴轉(zhuǎn)移率、脈管瘤栓率明顯高于陰性者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 HPV18型感染與預(yù)后的關(guān)系 110例患者的5年無瘤生存率及總生存率分別為86.36%(95/110)和89.09%(98/110)。其中HPV 18型陽性患者的5年無瘤生存率及總生存率分別為86.36%(57/66)和87.88% (58/66)；HPV 18型陰性患者分別為86.36%(38/44)、90.91%(40/44)，組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 0.000、0.249，P＞0.05)。HPV 18型陽性患者與陰性患者的無瘤生存時(shí)間、總生存時(shí)間比較差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表1 HPV18型陽性與病理特征的關(guān)系[例(%)]

表2 HPV18型感染與預(yù)后的關(guān)系(±s)

表2 HPV18型感染與預(yù)后的關(guān)系(±s)

組別HPV18型陽性HPV18型陰性t值P值例數(shù)66 44無瘤生存時(shí)間(月) 63.54±10.54 65.01±12.41 0.667＞0.05總生存時(shí)間(月) 73.87±12.66 75.11±13.68 0.487＞0.05

3 討 論

子宮頸癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率位居第三的婦科惡性腫瘤疾病，統(tǒng)計(jì)資料顯示全球每年的子宮頸癌新增病例逾52萬，死亡病例超過26萬，給女性的生理健康造成了嚴(yán)重的危害[3]。目前，臨床研究已明確子宮頸癌是由于高危型HPV持續(xù)感染所致。近期有文獻(xiàn)報(bào)道子宮頸癌的發(fā)生與HPV感染有著密切聯(lián)系，但是這類文獻(xiàn)多以子宮頸鱗癌為研究對(duì)象，關(guān)于子宮頸腺癌與HPV感染相關(guān)性的研究相對(duì)較少。

有研究顯示，宮頸腺癌患者HPV 18型的感染率為32%，并存在地區(qū)差異，在東南亞等地，子宮頸腺癌患者HPV 18型感染率更高[4]。本組研究結(jié)果顯示宮頸腺癌患者HPV 18型陽性66例(60.00%)，這一結(jié)果與東南亞多國的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[5]。近年來，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道HPV 18型感染是早期子宮頸癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。HPV 18型陽性宮頸神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者的預(yù)后不良率明顯高于陰性者[7]。還有文獻(xiàn)報(bào)道Ⅰb期子宮頸癌患者中，HPV 18型陽性者的復(fù)發(fā)率比陰性者更高[8]。臺(tái)灣也有研究顯示，行手術(shù)治療的早期子宮頸腺、鱗癌患者的預(yù)后與HPV 18型感染顯著相關(guān)[9]。但是，也有研究結(jié)果顯示子宮頸癌患者預(yù)后與HPV的負(fù)載量并無相關(guān)性。目前，關(guān)于子宮頸腺癌與HPV 18型感染相關(guān)性的研究報(bào)道較少，既有報(bào)道多認(rèn)為HPV 18型感染與腺癌患者預(yù)后無明顯相關(guān)性。有文獻(xiàn)報(bào)道行手術(shù)治療的早期子宮頸腺癌患者的5年生存率在60%～90%之間，無瘤生存率在68%～86%之間[10]。本次研究主要探討了其與宮頸腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，本組患者的5年無瘤生存率、總生存率分別為86.36%和89.09%，這一結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)果基本相符。本次研究還顯示HPV 18型陽性患者淋巴轉(zhuǎn)移率、脈管瘤栓率明顯高于陰性患者。說明HPV 18型感染與子宮頸腺癌患者的脈管內(nèi)瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在預(yù)后方面，結(jié)果則顯示HPV 18型陽性患者與陰性患者的無瘤生存時(shí)間、總生存時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明HPV 18型感染與患者的總生存時(shí)間、無瘤生存時(shí)間無顯著相關(guān)性。

綜上所述，HPV 18基因型感染與子宮頸腺癌患者的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其與患者的總生存時(shí)間、無瘤生存時(shí)間無明顯相關(guān)性。

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Correlation between HPV Type 18 and prognosis of patients with early adenocarcinoma of the cervix.

PAN Zai-xuan,CHEN Min.Department of Pathology,People's Hospital of Qionghai City,Qionghai 571400,Hainan,CHINA

Objective To discuss the correlation between the Human Papilloma Virus(HPV)Type 18 and early prognosis of patients with adenocarcinoma of the cervix.Methods One hundred and ten patients with adenocarcinoma of the cervix treated in People's Hospital of Qionghai City from Jan.2000 to Jan.2011 were selected as the study subjects.PCR was used to detect HPV genotype,and the correlation between HPV Type 18 and prognosis were analyzed. Results Among the 110 patients,66(60.00%)were detected with positive HPV Type 18.The lymph node metastasis, and vascular invasion rate of patients with positive HPV Type 18(27.27%,24.24%)were significantly higher than those of negative patients(6.82%,4.85%),P＜0.05.There were no significant differences in 5-year disease-free survival rate (86.36%vs 86.36%),5-year overall survival rate(87.88%vs 90.91%),disease-free survival time[(63.54±10.54)months vs(65.01±12.41)months]and overall survival time[(73.87±12.66)months vs(75.11±13.68)months]between the patients with positive HPV Type 18 and the negative patients(P＞0.05).Conclusion The genotype of HPV Type 18 infection is correlated with cancer cell metastasis of patients with adenocarcinoma of the cervix,but there is no obvious correlation between the overall survival and disease-free survival of the patients.

Adenocarcinoma of the cervix;HPV genotype;Prognosis;Correlation

R737.33

A

1003—6350（2016）17—2801—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.17.016

2016-03-07)

潘在軒。E-mail：zaixuanp@126.com