張 偉，徐益恒 綜述，邰文琳 校審

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,昆明 650101)

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·綜 述·

基因分型技術(shù)在院內(nèi)感染銅綠假單胞菌中的應(yīng)用研究進(jìn)展*

張 偉，徐益恒 綜述，邰文琳△校審

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,昆明 650101)

銅綠假單胞菌； 基因分型； 院內(nèi)感染

銅綠假單胞菌是世界范圍內(nèi)醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌。對引起疾病的病原菌基因分型的傳染源確定、阻止病原菌的傳播、潛在病原菌危險的控制和醫(yī)院耐藥監(jiān)測有很重要的作用。細(xì)菌分型作為分子流行病學(xué)研究調(diào)查的主要研究內(nèi)容,其結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于分型方法是否穩(wěn)定可靠、準(zhǔn)確[1]。細(xì)菌分型的方法包括依靠生理、生化特征的表型分型法和近年來流行使用的基因分型法。表型分型方法是根據(jù)細(xì)菌的生理、生化等表型特征進(jìn)行分類包括噬菌體分型法、血清型法、營養(yǎng)分型法和藥物敏感試驗(yàn)等，這些分型的方法由于受到細(xì)菌本身復(fù)雜因素及方法的敏感性因素影響，往往就無法有效對不同的菌株進(jìn)行區(qū)分，因此其應(yīng)用受到很大限制。運(yùn)用分子生物學(xué)方法檢測細(xì)菌基因型來鑒別菌株的基因分型法，是1980年起逐漸被引入微生物鑒定領(lǐng)域，成為目前較主流的流行病學(xué)研究工具，在基因組水平對細(xì)菌進(jìn)行鑒定與分類，與表型分型相比更加細(xì)化，對院內(nèi)引起感染的銅綠假單胞菌近親緣性，即克隆性菌株鑒定有重要意義，從根本上確定菌株遺傳基礎(chǔ)的相互聯(lián)系和變異，為流行病調(diào)查工作中確定菌株間的遺傳親緣關(guān)系等方面提供更為有力的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)[2]?；蚍中头壳斑\(yùn)用較多的有：重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(VNTR)、限制性片段長度多態(tài)性PCR(RFLP)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)。分型方法是在微生物學(xué)、遺傳學(xué)、流行病學(xué)等交叉學(xué)科一系列研究中的工具，選擇合適的方法，有效監(jiān)測院內(nèi)病原菌的分子流行病學(xué)變化，如此研究預(yù)期和最終目的才能達(dá)到?，F(xiàn)就目前常用于銅綠假單胞菌基因分型的技術(shù)進(jìn)行簡要介紹。

1 重復(fù)序列PCR

重復(fù)序列PCR是采用特定引物對細(xì)菌基因組重復(fù)序列的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，高度保守的重復(fù)序列之間的不同區(qū)域可表現(xiàn)不同的圖譜，然后經(jīng)凝膠電泳分析其多態(tài)性。目前，運(yùn)用最多的是腸桿菌基因間重復(fù)共有序列(ERIC)PCR，應(yīng)用于細(xì)菌分類和菌種鑒別。ERIC是最常用的一類引物，長度為126 bp，位于染色體非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)，ERIC-PCR分辨效果好，可重復(fù)性好，特別適用于基因型的辨別。PFGE目前被認(rèn)為是細(xì)菌基因分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。孫晶等[4]在對銅綠假單胞菌ERIC-PCR和PFGE方法學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法的符合率近90%，在ERIC-PCR方法重復(fù)5次的結(jié)果相似度高于75%；Han等[5]報道對銅綠假單胞菌研究中發(fā)現(xiàn)，在同一血清型中采用ERIC-PCR分出多個不同型別銅綠假單胞菌，采用ERIC-PCR分辨能力和重復(fù)性與PFGE很相近，均較血清分型方法較好，但ERIC-PCR用時短，操作簡單，成本低，值得在流行分子病學(xué)研究中推廣。在院內(nèi)感染耐藥監(jiān)測研究中，張勇等[6]對75株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌ERIC-PCR同源性分析，結(jié)果顯示分型為8種，但以A、B型為主，分別占34.7%和22.7%，表明耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌在院內(nèi)以克隆株傳播，ERIC-PCR是銅綠假單胞菌同源性分析有效工具，以其多種優(yōu)點(diǎn)在耐藥監(jiān)測和預(yù)防等方面有明顯的優(yōu)勢[7]。盡管ERIC-PCR有很多優(yōu)勢，但在近緣菌株分析中分辨力還有待加強(qiáng)，且此方法對軟件的要求和數(shù)據(jù)分析能力較高，普通實(shí)驗(yàn)室還難普及[8]。

2 RAPD

RAPD是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的一種新方法，該法使得對非血清型菌株從基因多態(tài)性的水平進(jìn)行分型的鑒定成為可能[9-10]。以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物，在熱穩(wěn)定的DNA 聚合酶(Taq酶)作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這種方法可對物種基因背景不清楚的情況下對基因組DNA水平進(jìn)行研究[11]。目前研究銅綠假單胞菌的特點(diǎn)主要在遺傳學(xué)分型、抗生素表型和血清學(xué)分型，主要是評價多種分離株關(guān)系的分型能力[12]。近來出現(xiàn)的RAPD-PCR方法對銅綠假單胞菌的多種細(xì)菌分型則成為可靠的手段，與傳統(tǒng)的對細(xì)菌鑒定分型方法比較，具有簡便、快速、靈敏度高，不需要已知基因組序列的優(yōu)勢[11-12]。RAPD技術(shù)是在基因水平上對菌株間差異進(jìn)行研究，最終可以表現(xiàn)出克隆間的差別和種系發(fā)育中的相互關(guān)系[13]。相異指數(shù)是RAPD技術(shù)中重要的指標(biāo)，是指對2個分離株進(jìn)行比較，相異指數(shù)越小，相似性越大。在聶道海等[14]報道中，采用Phylip和TREEview等軟件對RAPD指紋圖譜相異指數(shù)分析?；颊卟煌瑫r間的分離株相異指數(shù)最小為零，說明有可能克隆菌株。最大為89.47%，說明兩次感染來源不同。同一克隆株于空間上分布集中的趨勢,提示可能存在通過某一未識別的共同傳播源傳播同一病區(qū)來自不同患者的銅綠假單胞菌顯示相同的RAPD 型別,提供了醫(yī)院感染局部流行的證據(jù)。RAPD分型和耐藥譜分型比較研究中，RAPD分型譜相同，其耐藥譜也大致一樣，耐藥譜分型一致的，其RAPD分型可不同，說明RAPD分型譜和藥譜分型遺傳關(guān)系有一定的差異。所以，耐藥譜分型可作為RAPD分型進(jìn)一步補(bǔ)充分型。雖然RAPD技術(shù)簡便、對試驗(yàn)條件要求低的廣泛使用，但研究人員也慢慢意識該技術(shù)存在試驗(yàn)條件影響大、可重復(fù)性低等一系列問題。國內(nèi)外仍有很多實(shí)驗(yàn)采用該方法對菌株進(jìn)行流行病學(xué)研究和分型判斷[12]。

3 VNTR

VNTR是在原核和真核生物基因中一種重復(fù)DNA小序列，為10到幾百核苷酸，以首尾相連的方式串聯(lián)一起，拷貝數(shù)在10～1 000的PCR技術(shù)[15]。多態(tài)性指數(shù)(DI)是VNTR分型能力的一個指標(biāo)，DI值低，說明分型能力不好，特別是對近緣性菌株區(qū)分能力不足，DI值高，可導(dǎo)致非同源性相似。DI值在0.48～0.89，即可避免非同源性相似性，又有分型能力。近年來已有國內(nèi)外關(guān)于VNTR對銅綠假單胞菌基因分型的報道[16]。李艷君等[17]在銅綠假單胞菌院內(nèi)感染溯源性研究中采用VNTR方法，建立DI分布適中的12個VNTR新篩選位點(diǎn)方法，對98株銅綠假單胞菌進(jìn)行分型，共分類為5群，88個基因型，認(rèn)為同病房分離菌株有一定同源性。MLVA是基于VNTR方法發(fā)展起來的新技術(shù)。近來有研究以銅綠假單胞菌的全基因組序列為參考的多個VNTR 位點(diǎn)的MLVA 方法[18]。隨后有人在這基礎(chǔ)上建立15個VNTR位點(diǎn)的MLVA方法使分型更簡單、便捷，是目前MLVA對銅綠假單胞菌基因分型的主要研究方法[19]。不同的銅綠假單胞菌VNTR位點(diǎn)的數(shù)目數(shù)字化后，在數(shù)據(jù)庫中比對，菌株的差異就能用數(shù)字表達(dá)[20]。盡管采用數(shù)量不同的位點(diǎn)，都能進(jìn)行分型，且隨著技術(shù)的進(jìn)步分型能力越來好，但缺點(diǎn)是數(shù)量有限，而且在基因組上分布不均勻，這就極大限制其在基因定位中的應(yīng)用，VNTR也存在實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測時間長、成本高的不足。

4 RFLP

RFLP是指用不同的限制性內(nèi)切酶對DNA分子處理后，通過瓊脂糖凝膠電泳對DNA片段進(jìn)行分析。國外報道，RFLP也可以篩選出銅綠假單胞菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因，在流行病學(xué)基因研究、檢測新的變異有重要意義[21]。RFLP己被用于構(gòu)建基因組遺傳圖譜、基因定位、生物進(jìn)化和分類的研究。由于只對單拷貝基因組序列進(jìn)行鑒定，且需要多種內(nèi)切酶及探針，操作步驟繁瑣，但RFLP較之RAPD的優(yōu)勢是突變類型可以確定是由堿基突變或倒位、還是由插入缺失造成的。在RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析(AFLP)是一種新的標(biāo)記技術(shù)，是先采用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行切割，然后再將切割后的雙鏈接到DNA的末端，使鄰近的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和短的接頭序列作為結(jié)合位點(diǎn)。它擁有了RFLP的高效性和可靠性，但目前這一技術(shù)使用還不廣泛。

5 MLST

MLST方法近年來成為流行的基因分型方法，通過采取測定菌株多個管家基因的DNA序列進(jìn)行分型，管家基因幾乎不會發(fā)生遺傳漂變而存在于所有菌株中，所以采用管家基因進(jìn)行MLST分型[22]。測定7個管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA 和trpE)500 bp左右DNA序列片段代表基因組的分子多樣性，每個管家基因的等位基因由發(fā)現(xiàn)和遞呈的時間順序分配，每類菌株所有的等位基因號按照規(guī)定順序排列成為等位基因譜，也叫序列型(ST)[23]。此種方法不需要培養(yǎng)病原菌，可直接從標(biāo)本中進(jìn)行擴(kuò)增，獲得等位基因圖譜，有群體遺傳學(xué)分析的功能，且能夠準(zhǔn)確提供菌種評估的信息，比傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法更可靠和準(zhǔn)確，自從Gomila等[24]運(yùn)用此方法分析銅綠假單胞菌的遺傳多樣性，現(xiàn)MLST數(shù)據(jù)庫已建立且不斷完善，結(jié)果的可比性高，適合國際實(shí)驗(yàn)室間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，可以對局部感染爆發(fā)的評估和菌群結(jié)果的評價。目前運(yùn)用MLST分型對銅綠假單胞菌的研究越來越多。研究稱銅綠假單胞菌的遺傳背景是多樣性的。國外報道銅綠假單胞菌以ST235型最為常見，但也伴其他ST型[25]。銅綠假單胞菌容易引起暴發(fā)流行，在西班牙2007～2008年暴發(fā)兩起感染，是ST235所致[26]。韓國也有此型的多重耐藥菌株傳播。雖然MLST與PFGE和MLVA比較分辨力一般，但其結(jié)果可在全世界進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)傳播現(xiàn)象和分子流行病學(xué)研究，受到研究者的青睞。

6 PFGE

PFGE是采用限制性內(nèi)切酶(SpeⅠ酶)將DNA識別并內(nèi)切成若干片段，再脈沖場凝膠電泳，電場不斷在兩種方向(有一定夾角，而不是相反的兩個方向)變動，來分離大小從10 kb至10 Mb的DNA分子。因其分辨率高，重復(fù)性好被公認(rèn)為銅綠假單胞菌基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)[27]。其結(jié)果可作為控制醫(yī)院感染的重要基礎(chǔ)。能幫助臨床工作者發(fā)現(xiàn)潛在的危險因素，進(jìn)而及時切斷流行菌株的來源和傳播途徑。對不同患者分離的同一病原菌進(jìn)行親緣性分析，是判斷醫(yī)院是否存在散在性感染和暴發(fā)流行性感染的有效工具。自1984年報道了脈沖場電泳的方法以來，目前已得到全面發(fā)展，各種條件得到優(yōu)化，PulseNet細(xì)菌分子分型網(wǎng)絡(luò)提供技術(shù)下載，且Tenover等研究了結(jié)果的解釋標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)一技術(shù)對結(jié)果解釋的影響，利于PFGE技術(shù)的運(yùn)用，但是操作相對耗費(fèi)時間和精力且檢測通量小，導(dǎo)致其不能對大量菌株進(jìn)行研究，是其應(yīng)用的不足。

7 小 結(jié)

銅綠假單胞菌在院內(nèi)感染由于濫用抗菌藥物從而導(dǎo)致的變異，容易引起院內(nèi)的暴發(fā)流行，表型分型的不足采用基因分型方法彌補(bǔ)，但基因分型方法也存在不足，特別是不能解決院內(nèi)銅綠假單胞菌感染暴發(fā)流行的實(shí)時在線分析能力，也沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來對分型方法進(jìn)行指導(dǎo)，導(dǎo)致各種方法均有優(yōu)缺點(diǎn)。理想的分型方法有以下特征：對不同患者同一菌株的分型能力強(qiáng)且操作簡便、費(fèi)用低；對同一患者不同時期同一菌株高分辨能力，即將同一克隆或遺傳相近的菌株分辨出來；最重要的一點(diǎn)是具有良好的復(fù)現(xiàn)性。但目前的技術(shù)還不能做到。

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云南省衛(wèi)生科技計劃項(xiàng)目(2014NS114)；昆明醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2015S31)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.032

A

1673-4130(2016)23-3322-04

2016-05-28

2016-08-18)

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