李艷娜1 馬靈筠2
1河南省周口市西華縣人民醫(yī)院 466000;2河南科技大學(xué) 河南洛陽 471003
膠質(zhì)瘤細(xì)胞中巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的表達(dá)研究
李艷娜1 馬靈筠2(通訊作者)
1河南省周口市西華縣人民醫(yī)院 466000;2河南科技大學(xué) 河南洛陽 471003
目的研究巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)。方法購買A172,U87,U251,LN229,GaMG,pA及pB,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫組化、Western blot分析、RT-PCR和real-time PCR。結(jié)果Β微管蛋白Ⅲ型(classⅢ β-tubulin)、微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)均表達(dá)于2種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織、5種人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中,均在各種腫瘤細(xì)胞中均一表達(dá),但是神經(jīng)絲蛋白70不表達(dá)于這些腫瘤細(xì)胞中。NSE在胞質(zhì)核細(xì)胞核區(qū)域存在,但是和胞質(zhì)相比,細(xì)胞核區(qū)域具有顯著較高的染色輕度。classⅢ β-tubulin、NSE均在各種細(xì)胞系中均一表達(dá),但是MAP-2亞型在不同的細(xì)胞系或腫瘤組織中具有不同的含量,高分子量MAP-2在pA、U251、LN229中高表達(dá),低分子量MAP-2在pB、A172、U87、GaMG中高表達(dá),同時(shí)將兩種不同分子量的MAP-2表達(dá)出來。結(jié)論巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)均隨著周圍環(huán)境的變化而變化。
巢蛋白;神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白;神經(jīng)元特異性烯醇化酶;膠質(zhì)瘤細(xì)胞;表達(dá)
本文研究通過研究巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)情況及其在不同環(huán)境中的調(diào)控作用,并探討其表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系,利于后期膠質(zhì)瘤的診斷及治療,具有重要實(shí)踐意義,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 材料
購買美國ATCC公司生產(chǎn)的A172,U87,U251,LN229,采用諾美卑爾根大學(xué)提供的GaMG,從挪威霍蘭山大學(xué)醫(yī)院神經(jīng)外科病人膠質(zhì)瘤標(biāo)本中提取pA及pB。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境,進(jìn)行細(xì)胞傳代,凍存細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇及細(xì)胞計(jì)數(shù)。
1.2.2 細(xì)胞免疫組化
1)細(xì)胞標(biāo)本制作。將一層放置在37℃的溫度下2h的50μ g/ml聚左旋賴氨酸涂在12mm蓋玻片上,然后將適量細(xì)胞種植出來,2-3d細(xì)胞爬片。用PBS對(duì)標(biāo)本進(jìn)行2次清洗,用4%多聚甲醛進(jìn)行10min的固定。用0.5%Triton X-100對(duì)標(biāo)本進(jìn)行4min的透化處理。用PBS對(duì)標(biāo)本進(jìn)行3次清洗,將PBS加入其中后在4℃的冰箱中放置將其保存起來;2)免疫染色。室溫下在封閉液中對(duì)細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行15min的放置,37℃下將細(xì)胞標(biāo)本和一抗進(jìn)行45min的孵育或4℃將細(xì)胞標(biāo)本和一抗孵育過夜。用PBS對(duì)標(biāo)本進(jìn)行3次清洗,每次5min。37℃下將標(biāo)本和二抗工作液進(jìn)行45min的孵育。用PBS對(duì)標(biāo)本進(jìn)行3次清洗,每次5min,然后用三蒸水對(duì)其進(jìn)行1次清洗。在每個(gè)標(biāo)本中加入5μlVectashield固定液,其中含DAPI,常溫下避光保存,時(shí)長為2h,將蓋玻片邊緣封閉住,在此過程中將指甲油充分利用起來。檢查結(jié)果并將其保存下來,在此過程中將尼康Eclipse TE2000-E熒光顯微鏡充分利用起來。
1.2.3 Western blot分析
制備蛋白樣品,測(cè)定蛋白濃度,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,在1.5ml的離心管中將18μl樣本準(zhǔn)備出來,70℃下對(duì)混合樣本進(jìn)行10min的加熱。組裝玻璃板和12孔NuPage 4-12%Bis-Tris膠,將500μl抗氧化劑及1倍NuPage MOPS SDS電泳緩沖液加入到電泳槽中,將1倍電泳緩沖液加入到外面空間中。將膠底部的氣泡排出,在上樣孔中加入15μl處理好的樣品及7μl SeeBlue Plus2 Prestained標(biāo)準(zhǔn)。插上電極, 200V下進(jìn)行5min電泳。電泳過程中應(yīng)該對(duì)電壓及電泳時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié),在此過程中嚴(yán)格依據(jù)分子量。將膠從玻璃板上取下時(shí)應(yīng)該從下端開始對(duì)凝膠進(jìn)行剝離,使較自然脫落。然后轉(zhuǎn)膜,最后分析化學(xué)發(fā)光及結(jié)果。
1.2.4 RT-PCR和real-time PCR
提取細(xì)胞系總RNA,進(jìn)行RNA定量,然后進(jìn)行RT-PCT,最后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,分析過程中將LCS480軟件充分利用起來,向Excel中導(dǎo)入,運(yùn)用CT(2-△△CT)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。常規(guī)統(tǒng)計(jì)及t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)采用軟件SPSS19.0,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
膠質(zhì)瘤源自神經(jīng)上皮細(xì)胞的腫瘤總稱,約占顱腦腫瘤的45%[1],屬于臨床中較為常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。臨床學(xué)者提出了多種關(guān)于膠質(zhì)瘤的起源及發(fā)展的假說,其中普遍認(rèn)可腫瘤干細(xì)胞模型及克隆演變模型[2]。長期以來,膠質(zhì)瘤認(rèn)為起源于腦間質(zhì)中的膠質(zhì)細(xì)胞,且有部分學(xué)者通過研究表明:膠質(zhì)瘤中表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物,少數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中含有神經(jīng)元特異性的離子通道。膠質(zhì)瘤形成過程中極易使得神經(jīng)元的不完全分化,或者來源膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤的惡心演變中,處于分化。惡性顱腦腫瘤往往包含較顯著的細(xì)胞異質(zhì)性,膠質(zhì)瘤細(xì)胞中含有其他多種類型的標(biāo)記物,如:神經(jīng)元標(biāo)記物。因此,研究巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)研究具有重要意義。本研究結(jié)果表明,巢蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)均隨著周圍環(huán)境的變化而變化,值得臨床充分重視。
[1]張晉,金貴善,米蕊芳等.神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的差異基因表達(dá)譜的分析[J].中華神經(jīng)外科雜志,2015,31(3):299-303.
[2]陸娜,馮曉源,邸悅等.CT灌注成像評(píng)價(jià)人腦膠質(zhì)瘤腫瘤血管生成[J].中國醫(yī)學(xué)計(jì)算機(jī)成像雜志,2014,20(6):481-484.
R329
A
1672-5018(2016)10-127-01
1.李艷娜,(1982,10--),女,漢族,河南西華縣人。本科學(xué)歷,河南省周口市西華縣人民醫(yī)院職工,現(xiàn)西華縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科工作。2.馬靈筠 通訊作者,女 河南科技大學(xué)教授,碩士生導(dǎo)師,從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)與研究