李 蘭 劉東梅

安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校護(hù)理學(xué)部 安徽合肥 230601

乙酰葛根素對(duì)氧糖剝離致神經(jīng)元損傷的干預(yù)作用

李 蘭 劉東梅

安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護(hù)理學(xué)部 安徽合肥 230601

本文主要通過三組實(shí)驗(yàn)來研究乙酰葛根素氧糖剝離對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的干預(yù)作用。研究方法在氧糖剝離的基礎(chǔ)上建立細(xì)胞模型；利用6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）法觀察神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率；利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)細(xì)胞核因子（或稱為K基因結(jié)合核因子）、蛋白質(zhì)（HIF-1α）以及P53基因的表達(dá)；利用蛋白印跡法或免疫印跡的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定熱休克蛋白70（Hsp70）的含量以及三種不同濃度的乙酰葛根素對(duì)熱休克蛋白70的影響。

乙酰葛根素；氧糖剝離；熱休克蛋白

腦中風(fēng)又被稱為腦卒中或腦血管意外是一種急發(fā)的高死亡率的病癥，病因是腦部血液循環(huán)障礙而引起的大腦局部功能缺失導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其細(xì)胞的死亡有凋亡和壞死這兩種形式。缺血性腦中風(fēng)中心區(qū)的細(xì)胞死亡是由細(xì)胞壞死導(dǎo)致的，而中心區(qū)周圍的細(xì)胞死亡是由細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致的[1]。凋亡的細(xì)胞，如果不及時(shí)供血一般在數(shù)小時(shí)或幾周內(nèi)將會(huì)死亡，如果供血及時(shí)凋亡的細(xì)胞會(huì)因血供恢復(fù)而得到復(fù)蘇。因此，如果能研制出具有保護(hù)腦缺血功能的藥物就能夠有效降低缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元的凋亡率，從而降低因腦中風(fēng)而導(dǎo)致的死亡率[2-3]。乙酰葛根素是對(duì)葛根中提煉出的葛根素進(jìn)行改造化學(xué)結(jié)構(gòu)引入側(cè)鏈后得到的一種新型異黃酮類化合物其結(jié)構(gòu)，相對(duì)葛根素其脂溶性增加，透過血腦屏障的能力明顯提高。

實(shí)驗(yàn)中，我們采用國內(nèi)外常用的體外氧糖剝離模型，研究乙酰葛根素對(duì)胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡起到的保護(hù)作用，并對(duì)影響機(jī)制進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 進(jìn)行胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)

完全培養(yǎng)液為神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基（NB）、1.2摩爾/L的谷酰胺、蛋白基因B27（20 ml·）、青霉素（50 k U·）以及鏈霉素（50 mg·）。試驗(yàn)開始后間隔3天換一次溶液，到第7天或者第八天開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)均需重復(fù) 3 次，所用胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞要來自于 3 只不同的孕鼠。

1.2 氧糖剝奪及分組

正常對(duì)照組：換成含糖酚紅液，置入二氧化碳培養(yǎng)箱，三小時(shí)后換成神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基完全培養(yǎng)液孵育（不含蛋白基因）。氧糖剝奪/R-24 h 組：最先將無糖酚紅液滴入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中半小時(shí)，氧的濃度保持低于1%。用無糖酚紅液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行4次清洗，每次使用的無糖酚紅液為原培養(yǎng)液體積的 2/3，葡萄糖的濃度保持低于1摩爾/L。細(xì)胞在厭氧罐內(nèi)放置三小時(shí)后換神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基完全培養(yǎng)液（不含蛋白基因），然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行一天的孵育。藥物處理組：在換無糖酚紅液及氧糖剝奪結(jié)束后換成神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基完全培養(yǎng)液（不含不含蛋白基因）時(shí)，分別在三組胎鼠中加入低、中、高不同濃度濃度的乙酰葛根素，低濃度為 0.1摩爾/L、中濃度為0.4摩爾/L、高濃度為1.6摩爾/L，其余處置同上。

1.3 6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚檢測(cè)

加入 2.5摩爾/L的6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚染料，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。如果染色較亮，染色質(zhì)濃縮，甚至出現(xiàn)碎裂的細(xì)胞就是凋亡樣的陽性細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的計(jì)算方法在顯微鏡觀測(cè)下隨機(jī)所選取5個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)占總計(jì)數(shù)的百分率。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

實(shí)驗(yàn)過程可參照試劑盒的說明進(jìn)行。結(jié)果采用阿爾法緩解俱樂部軟件進(jìn)行分析，用目標(biāo)產(chǎn)物與肌動(dòng)蛋白的光密度比值來表示各組信使核糖酸的水平。

1.5 利用免疫印跡法使神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解，

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后在半干狀態(tài)下轉(zhuǎn)運(yùn)至聚偏氟乙烯膜上，加熱激蛋白70山羊抗一抗（1∶400），過夜溫度保持在4℃，加入二抗（1∶5000），利用化學(xué)發(fā)光法使其顯色。

2 ．結(jié)果

2.1 乙酰葛根素對(duì)氧糖剝離/R-24 h 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率的影響

氧糖剝奪的海馬神經(jīng)細(xì)胞顯示有凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，試驗(yàn)中采用低濃度0.1摩爾/L、中濃度0.4摩爾/L、高濃度為1.6摩爾/L的乙酰葛根素，低濃度的乙酰葛根素使凋亡的陽性細(xì)胞的數(shù)目降至63.01% ±7.35%、中濃度的將至 59.06% ±5.98%、高濃度的將至 51.05% ±5.98%。根據(jù)三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出中和高濃度的乙酰葛根素對(duì)氧糖剝奪/R-24 h導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用（P＜ 0.05）。

2．2 乙酰葛根素對(duì)氧糖剝奪/R-24 h 所致的核轉(zhuǎn)錄因子、缺氧誘導(dǎo)因子以及p53信使核糖酸表達(dá)的影響

核轉(zhuǎn)錄因子在腦細(xì)胞缺血以及再灌注中的具體作用還存有異議。在本次實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的乙酰葛根素可以使已經(jīng)升高的核轉(zhuǎn)錄因子以及信使DNA降低。缺氧誘導(dǎo)因子以及信使核糖酸在海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，乙酰葛根素可使氧糖剝奪/R-24 h 后升高的缺氧誘導(dǎo)因子及p53信使核糖酸水平降低。

2.3 乙酰葛根素對(duì)氧糖剝奪/R-24h所致熱休克蛋白70表達(dá)的影響

熱休克蛋白70是一種高度保守的蛋白，會(huì)隨著腦細(xì)胞缺血而升高，能夠?qū)κ軗p海馬細(xì)胞起到保護(hù)作用。為了觀測(cè)乙酰葛根素的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用是否會(huì)關(guān)系到熱休克蛋白70的改變，我們通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了各組胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞熱休克蛋白70 的表達(dá)。氧糖剝奪/R-24 h后熱休克蛋白70的表達(dá)值保持在0.23±0.08，分別加入低、中、高濃度的乙酰葛根素后，對(duì)應(yīng)的表達(dá)值為低濃度0.49±0.16、中濃度0.73±0.08、高濃度1.11±0.24，加入前后具有顯著的差異。

通過對(duì)三組胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，可得出以下結(jié)論 不同濃度的乙酰葛根素能夠使熱休克蛋白70有很明顯的升高，能夠增強(qiáng)機(jī)體海馬神經(jīng)元對(duì)缺血損傷的抵抗能力。綜上所述，乙酰葛根素對(duì)體外氧糖剝離的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，保護(hù)機(jī)制涉及到相關(guān)凋亡因子的改變。

[1]宋修云，胡金風(fēng)，陳乃宏．神經(jīng)細(xì)胞凋亡與腦缺血疾?。跩］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（3）：307 - 10．

R285.5

A

1672-5018（2016）07-037-01

安徽省高校自然科學(xué)研究一般項(xiàng)目（編號(hào)：12925KJ2015B06）