黃清霞，盧　靖，張冬梅，王佳雯，王　健*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

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胚胎大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)及神經(jīng)元鑒定

黃清霞1，盧靖1，張冬梅2，王佳雯3，王健2*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

(ChinJLabDiagn,2016,20:0001)

隨著現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，在多個(gè)研究領(lǐng)域中原代大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)日益被廣泛應(yīng)用，不僅促進(jìn)了對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步了解,還為大腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制研究及藥物的作用機(jī)制研究提供了一個(gè)平臺(tái)。但在具體的實(shí)驗(yàn)操作中,胎鼠大腦皮層神經(jīng)元的分離和體外培養(yǎng)方面仍然存在一系列問題，如胎鼠胎齡難以控制，新生鼠進(jìn)行神經(jīng)元培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞存活率較低，細(xì)胞數(shù)量少、細(xì)胞損傷大及神經(jīng)元純度欠佳等，嚴(yán)重限制了后續(xù)研究的進(jìn)行。因此，本研究在參照相關(guān)文獻(xiàn)[1-5]及反復(fù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)細(xì)胞消化及重懸細(xì)胞等步驟進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，得到了較理想的培養(yǎng)結(jié)果。詳情如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物將適齡的Wistar大鼠(吉大醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)雌雄各一只合籠過夜,次日觀察，以見到陰栓開始將該雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)并計(jì)算時(shí)間。以24 h為1 d,至第16 d時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及溶液的配制多聚賴氨酸(分子量70,000-150,000)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。L-谷氨酰胺(200 mM 100X)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。細(xì)胞爬片(24孔)購(gòu)自alafa公司。胎牛血清購(gòu)自四季青公司。B27、Neurobasal神經(jīng)元專用培養(yǎng)液、兔抗大鼠一抗、山羊抗兔熒光二抗購(gòu)自美國(guó)life公司。PBS緩沖液pH調(diào)至7.3-7.4，高壓滅菌，4℃保存。PDL包被液：用三蒸水配制1 mg/ml的PDL儲(chǔ)液，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。含血清培養(yǎng)液：87%Neurobasal+2%B27(50×)+1%L-glutamine(200 mmol/L)+10%胎牛血清，混勻，4℃保存。無(wú)血清培養(yǎng)液：97%Neurobasal+2%B27(50×)+1%L-glutamine(200 mmol/L)，混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3培養(yǎng)板及爬片的預(yù)處理用0.1 mmol/ml的多聚賴氨酸，分別包被12孔培養(yǎng)板及24孔爬片(用于神經(jīng)元鑒定)。37℃孵育箱內(nèi)放置過夜。多聚賴氨酸預(yù)處理24 h后將液體吸出,自然干燥后,無(wú)菌超純水沖洗2遍，置超凈臺(tái)內(nèi)備用(避光保存)。

1.2方法

1.2.1神經(jīng)元體外培養(yǎng)取1只孕第16-18 d的Wistar大鼠,脫錐處死并固定，75%酒精局部消毒腹部，開腹，分離子宮并消毒，迅速穿破羊水取出胎鼠，去除胎盤，將胎鼠置于預(yù)冷的PBS溶液內(nèi)并轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，無(wú)菌條件下用尖鑷剝?nèi)ビ材X膜，暴露兩側(cè)大腦半球，取出大腦，轉(zhuǎn)移至DMEM溶液中繼續(xù)剝軟腦膜，分離出皮層,用PBS平衡鹽溶液清洗2遍，剪成1 mm3或更小碎塊；加胰酶,37℃消化10 min，每隔3 min輕輕搖晃1次,用拋光過的移液管吸取上清，再對(duì)剩余組織進(jìn)行2次消化10 min，吸取上清至等體積DMEM+10%胎牛血清+1‰雙抗中，均勻抽吸20-25次，終止消化，70 μm尼龍網(wǎng)篩過濾雜質(zhì)，室溫800 r/min離心5 min,棄上清，加入含10%血清的Neurobasal培養(yǎng)液重懸。細(xì)胞計(jì)數(shù)后以9.0×105-1.0×106個(gè)/ml的密度將細(xì)胞接種至預(yù)先處理過的孔板內(nèi),12孔板1 ml/孔，24孔板0.5 mL/孔，5%CO2、37℃孵箱孵育，4-5 h后用無(wú)血清Neurobasal培養(yǎng)基全量換液。體外培養(yǎng)第3 d以終濃度5μmol/L的阿糖胞苷(抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng))作用24 h后換液。此后每3 d換液1次,體外培養(yǎng)第7-12 d的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2形態(tài)學(xué)觀察及鑒定細(xì)胞種板后,定期在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并記錄。神經(jīng)元鑒定：細(xì)胞種板的第5 d，在長(zhǎng)滿細(xì)胞的爬片上加入預(yù)冷4%的多聚甲醛，300 μl/孔，4℃固定細(xì)胞15 min，沿一邊吸去多聚甲醛，注意不要碰到細(xì)胞，PBS洗3次，每次5 min。用0.5%TritonX-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透，時(shí)間為15 min,然后加入封閉液(10%胎牛血清)室溫封閉1 h。小心取出爬片，放在自制板上，一抗(1%胎牛血清1∶1 000稀釋)200 μl/片，垂直加，把爬片鋪滿，放入小盒中，底部放PBS保持濕度，37℃2 h，PBS清洗2次，加入二抗(1%胎牛血清1∶1000稀釋)，室溫避光孵育45 min-1 h。PBS洗1次，室溫下加入33258核染色5 min，在載玻片上用50%丙三醇封片，熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值作為神經(jīng)元陽(yáng)性率。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)元純度鑒定

免疫熒光結(jié)果顯示，神經(jīng)細(xì)胞占的比例較高，突起走形正常，形態(tài)符合神經(jīng)元的基本特征，核大而清晰，陽(yáng)性率達(dá)90%以上。

2.2倒置相差顯微鏡觀察

觀察剛種板的神經(jīng)細(xì)胞，分布均勻，呈圓形，無(wú)色透明，折光性較強(qiáng)(圖1)；1 d后神經(jīng)元已全部貼壁，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞周邊有光暈，部分細(xì)胞呈梭形，有伸長(zhǎng)的突起，但細(xì)胞間連接較少(圖2)；3 d后細(xì)胞形態(tài)比較典型：胞體飽滿，大多數(shù)細(xì)胞呈梭形，少數(shù)為多邊形，突觸之間相互連接，可見少數(shù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖3)；4 d加完阿糖胞苷后，背景中幾乎不見扁平多邊形的膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元胞體逐漸增大,突起進(jìn)一步延伸并連接成網(wǎng)(圖4)；第7 d，原方法培養(yǎng)的細(xì)胞中有部分存活的細(xì)胞，但胞體逐漸縮小聚集，突起縮短，細(xì)胞抱團(tuán)，狀態(tài)不能用于實(shí)驗(yàn)(圖5)；而用改進(jìn)后方法培養(yǎng)的細(xì)胞，形態(tài)良好,連接緊密，分布均勻，可用于實(shí)驗(yàn)(圖6)。

圖1　剛種板神經(jīng)元形態(tài)(20×)　　圖2　培養(yǎng)1 d神經(jīng)元形態(tài)(10×)　　圖3　培養(yǎng)3 d神經(jīng)元形態(tài)(20×)

3討論

大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，在消化細(xì)胞時(shí)，通常用0.25%Trypsin對(duì)大腦皮層組織進(jìn)行一次消化(20 min)，但經(jīng)過前期的探索研究發(fā)現(xiàn)用該法消化得到的細(xì)胞損失較大，存活力低，最終達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。其原因可能是Trypsin消化細(xì)胞時(shí)，先分離下來(lái)的細(xì)胞易消化過度，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。經(jīng)過改進(jìn)后，本實(shí)驗(yàn)采用2次消化法分離，對(duì)細(xì)胞損傷更小且獲得的細(xì)胞更多。

圖4　培養(yǎng)4d加完阿糖胞苷后神經(jīng)元形態(tài)(20×)　　　圖5　原方法培養(yǎng)7d神經(jīng)元形態(tài)(10×)　　　圖6　改進(jìn)方法培養(yǎng)7d神經(jīng)元形態(tài)(10×)　　　　　　　　

國(guó)內(nèi)外有關(guān)皮質(zhì)神經(jīng)元取材公認(rèn)的是采用胚胎大鼠作為神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)組織來(lái)源的種屬[9]，因?yàn)樵诖笫笈咛グl(fā)育16-18 d時(shí)細(xì)胞正處于分裂時(shí)期、繁殖階段，取此時(shí)的神經(jīng)元進(jìn)行培養(yǎng)，存活的細(xì)胞數(shù)相對(duì)就較多，利用此階段的大鼠胚胎提取神經(jīng)元可以提高細(xì)胞的成活率并能較好地控制雜質(zhì)細(xì)胞的百分含量。但在實(shí)際應(yīng)用中卻較多采用新生鼠培養(yǎng)神經(jīng)元，因?yàn)槭褂锰ナ箅y以精確控制胎齡以致費(fèi)用較高、取材困難等缺點(diǎn)。在本研究中我們采用單獨(dú)合籠，觀察陰栓的方法建立了1種低成本并簡(jiǎn)便易行的獲得胎鼠以培養(yǎng)神經(jīng)元的方法。

目前多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-12]在接種細(xì)胞時(shí)用加血清的DMEM重懸細(xì)胞，12 h后才全量換成神經(jīng)元培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這樣不利于神經(jīng)元生長(zhǎng)，換液間隔時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)過多，細(xì)胞純度降低。在本實(shí)驗(yàn)中，我們用含血清的神經(jīng)元培養(yǎng)液種板，在接種細(xì)胞4-5 h時(shí)換成無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。胎牛血清能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞貼壁，大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞種板5 h后細(xì)胞大部分已經(jīng)貼壁牢固而細(xì)胞碎片還沒有貼壁完全，此時(shí)換液能去除細(xì)胞碎片及還未貼壁的膠質(zhì)細(xì)胞[13]。大腦皮層神經(jīng)元接種超過12 h后，細(xì)胞碎片已經(jīng)貼壁牢固，直接影響神經(jīng)元的存活，并且膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，所以換培養(yǎng)液時(shí)間為4-5 h最適宜。

本研究對(duì)神經(jīng)元培養(yǎng)過程中獲取孕鼠，細(xì)胞消化以及培養(yǎng)液等方面進(jìn)行了改良。在采用此方法以后，無(wú)論是在神經(jīng)元的數(shù)量及純度上，或是生長(zhǎng)狀態(tài)上，都有較大的進(jìn)步，這對(duì)以原代培養(yǎng)神經(jīng)元作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究而言尤為重要。

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摘要：目的對(duì)原有的胚胎大鼠神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)進(jìn)行改進(jìn)，建立一種高效、穩(wěn)定的的原代培養(yǎng)方法。方法自精確控制胎齡的大鼠胚胎大腦中分離出皮質(zhì)，采用胰酶二次消化法制備神經(jīng)細(xì)胞懸液。并選用神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫熒光化學(xué)法對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果與單次消化法分離細(xì)胞及運(yùn)用DMEM+10%胎牛血清重懸細(xì)胞進(jìn)行種板的原方法相比,方法改進(jìn)以后，細(xì)胞提取數(shù)量明顯增加,且純度較高。種板后細(xì)胞形態(tài)正常且能長(zhǎng)期存活。結(jié)論該方法結(jié)果理想,簡(jiǎn)易高效,值得借鑒和推廣。

關(guān)鍵詞：胎鼠;神經(jīng)元;原代培養(yǎng)

The primary culture of embryonic rat cortical neurons and neurons identificationHUANGQing-xia,LUJing,ZHANGDong-mei,etal.(TheChangchunUniversityofChineseMedicine；TheaffiliatedHospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a highly efficient and stable method for the primary culture by modified the original method of cultureing embryonic rat cortical neurons.Methods Cerebral cortex isolated from the precise control of gestational age was dissociated to single cells by the twice-enzyme isolation method.Immunofluorescence of neuronspecific enolase chemical methods was used to identify neurons.ResultsThe improved method could markably increase the number of cells and the purity compared to the original method of single digestion method and suspending cells use the DMEM+10%fetal bovine serum.The plateing neurons was eumorphism and has long-time livability.ConclusionThe experimental method has a ideal result also is simple and efficient that is worth to reference and generalize.

Key words:fetal rat;neuron;primary culture

(收稿日期：2015-09-18)

中圖分類號(hào)：R741

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-4287(2016)01-0001-03

*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473576);吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20150101251JC)；吉林省衛(wèi)生計(jì)生委科研計(jì)劃項(xiàng)目(2014Z100)；吉林省中醫(yī)藥管理局青年基金項(xiàng)目(2014-Q2)