拜薛鵬，南欣榮，閆星泉，劉典偉

(山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)院口腔頜面外科，太原 030001;*通訊作者，E-mail:xr_nan@sina.com)

先天性腭裂是一種多基因遺傳病，其發(fā)病機制不清楚，現(xiàn)多數(shù)學者認為是基因和環(huán)境聯(lián)合作用引起，所以腭裂發(fā)病機制的研究有助于腭裂的預防和產(chǎn)前診斷。通過對一些化學藥物產(chǎn)生腭裂的研究，已能初步指出維生素A族缺乏或過量均可導致腭裂發(fā)生率增高［1，2］，其中 RA 是致畸作用最強的一種。本研究擬通過研究在特定妊娠期給予BALB/c近交系小鼠腭裂模型所需維甲酸(retinoic acid，RA)的最佳劑量，為之后研究致畸分子機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試劑

RA(Sigma公司)于－20℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆?。使用時取出，在避光條件下溶于相應容量的玉米油(100 mg RA溶于10 ml玉米油，RA為10 mg/ml)，將其震蕩混勻，立即管飼孕鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng) 選取9周齡BALB/c近交系小鼠(山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，體重20－25 g，飼養(yǎng)在(25±2)℃和人工調(diào)控12 h晝夜循環(huán)條件下，任意給予食物和水。將未交配生育過的雌雄小鼠于第1天下午6:00雌雄3:1合籠交配，第2天上午8:00查看陰栓，有陰栓者定為妊娠(gestation day，GD)0 d，標記并稱體重，取出單獨飼養(yǎng)。GD8 d時稱重見陰栓的雌鼠，體重增加小于2.0 g者判定為假孕，取出重新交配，體重增加大于或等于2.0 g者判定為受孕，用于實驗。

1.2.2 分組及給藥 將孕鼠36只，隨機分為實驗組和對照組，實驗組:共30只，分為5個組，每組6只，其中三組分別在 GD8 d，GD10 d，GD12 d，上午8:00一次性管飼RA玉米油懸液，劑量均為50 mg/kg，其余兩組則于GD10d上午8:00一次性管飼RA玉米油懸液，劑量分別為40 mg/kg和60 mg/kg;另設對照組:共6只，按給藥時間分為3組，每組各2只小鼠，分別于 GD8 d，GD10 d，GD12 d上午8:00一次性管飼與實驗組等劑量的玉米油。

1.3 胎鼠致畸形及毒性的檢測

記錄胎鼠總數(shù)、腭裂胎鼠數(shù)、每窩胎鼠平均體重。以腭裂比率來評估RA誘導胎鼠腭裂畸形的情況，以胎鼠平均體重評估RA對胎鼠的毒性作用。

1.4 標本的制備與染色

GD17 d處死全部孕鼠，剖腹取出胎鼠，觀察胎鼠的畸形情況。計算每個胚胎的體重。在體視顯微鏡下應用顯微外科器械剪取腭突。并將部分實驗組和對照組胎鼠的鼠頭脫水、浸蠟、包埋、切片，切片以麥克爾軟骨為基準面，作冠狀位約5μm連續(xù)切片，HE染色。觀察胎鼠兩側(cè)腭突融合情況。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對胎鼠體重變化進行方差分析。對胚胎腭裂發(fā)生情況進行χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胎鼠體重變化分析

GD10 d RA處理孕鼠，50 mg/kg RA及60 mg/kg RA實驗組胎鼠均重與對照組(0 mg/kg)胎鼠均重之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見表1)，而40 mg/kg RA實驗組胎鼠均重與對照組胎鼠均重比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.181)，50 mg/kg與60 mg/kg RA實驗組胎鼠均重比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);其余各實驗組胎鼠均重之間差異有顯著性(P＜0.05)。50 mg/kg RA對BALB/c近交系小鼠有較強的毒性作用。

GD8d實驗組胎鼠均重與對照組胎鼠均重之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見表2)，GD10 d實驗組與對照組胎鼠均重之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而GD12 d實驗組與對照組胎鼠均重之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);50 mg/kg RA處理孕鼠，GD8 d、GD10 d和GD12 d胎鼠均重之間差異有統(tǒng)計學意義(F=73.075，P＜0.05，見表2)。GD8 d和GD10d是誘發(fā)BALB/c小鼠畸形的敏感時期。

表1 妊娠10 d胎鼠體重分布(±s)Table 1 The weight of GD10 d embryos after exposed to different doses of RA(±s)

表1 妊娠10 d胎鼠體重分布(±s)Table 1 The weight of GD10 d embryos after exposed to different doses of RA(±s)

?

與0mg/kg比較，*P＜0.05;與40mg/kg比較，#P＜0.05

表2 不同給藥時間對各組胎鼠體重的影響(±s)Table 2 The weight of embryo in each group at different feeding time(±s)

表2 不同給藥時間對各組胎鼠體重的影響(±s)Table 2 The weight of embryo in each group at different feeding time(±s)

與0mg/kg比較，*P＜0.05

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2.2 胚鼠腭裂發(fā)生情況

表3結(jié)果顯示:50 mg/kg RA劑量組腭裂發(fā)生率為93.75%，40 mg/kg與60 mg/kg劑量組腭裂發(fā)生率都為0.00%，故認定劑量50 mg/kg RA為誘導腭裂畸形發(fā)生最佳用藥劑量(P＜0.05)。其中GD8 d和GD12 d給藥腭裂的發(fā)生率分別為36.00% 和45.83%，而GD10 d給藥腭裂的發(fā)生率最高(P＜0.05)，故認定GD10 d為RA誘導BALB/c小鼠腭裂畸形發(fā)生的最佳用藥時間。

表3 不同處理條件下各組胎鼠腭裂發(fā)生情況Table 3 The incidence of cleft palate after exposed to different doses of RA at different time

2.3 胎鼠腭裂的形態(tài)學觀察

2.3.1 肉眼觀察 肉眼觀察胎鼠腭裂模型，可見胎鼠腭部正中有邊緣不太規(guī)整的裂隙，其長度一般為1.2－2.6cm，最寬處有0.8 cm(見圖1)。

圖1 體視鏡下觀察胎鼠腭裂畸形發(fā)生情況 (×4)Figure 1 Observation of cleft palate under stereoscope (×4)

圖2 HE染色觀察胎鼠兩側(cè)腭突細胞發(fā)生融合情況 (HE，×40)Figure 2 Morphology of both sides of palatal cells in mice at GD17 d (HE，×40)

2.3.2 光鏡觀察 HE染色顯示:GD17d對照組胎鼠兩側(cè)腭突上抬至舌體完全接觸融合，腭突細胞相互連接貫通形成完整的腭板;GD17 d腭裂組胎鼠絕大多數(shù)兩側(cè)腭突小但能上抬至正常水平并向水平方向生長，體積較小，不能在中線處相互接觸形成腭融合板(圖2，見第81頁)。

3 討論

先天性腭裂動物模型主要用于腭裂病因?qū)W和發(fā)生機制方面的研究，目前多用地塞米松、氫化可的松和全反式維甲酸等藥物誘導腭裂動物模型，而全反式維甲酸被認為是近年來致畸研究中的一種具有較強的致畸作用的化學藥物，主要通過結(jié)合維A酸受體調(diào)節(jié)下游靶基因表達來實現(xiàn)其生物學效應［3，4］。

在小鼠懷孕不同時間即孕8，10，12 d給予一定劑量的維甲酸均能誘發(fā)腭裂。Kochhar等［5］認為GD8 d抑制神經(jīng)嵴細胞的正常遷移，使腭突缺少足夠的起源細胞而導致發(fā)育不足，形成腭裂。Harris等［6］認為，GD10 d抑制了腭突間充質(zhì)細胞的增殖，并影響了中嵴上皮的轉(zhuǎn)歸而導致腭裂。而在GD12 d并不抑制腭間充質(zhì)細胞的增殖，而是干擾了腭的上抬、腭中嵴上皮細胞的分化以及腭的粘連融合等過程形成腭裂。呂寶輝等［7］以RA為致畸物，誘發(fā)C57BL近交系小鼠腭裂，成功建立了腭裂動物模型，其結(jié)果顯示:GD10 d為最佳致畸時間，100 mg/kg RA為最佳致畸量。Reynolds等［8］對GD10 d的Swiss Webster小鼠一次性管飼50 mg/kg RA誘導出100%腭裂小鼠模型。然而，我們所做預實驗得出:當RA劑量為100 mg/kg對BALB/c近交系小鼠是致死劑量，最終確定50 mg/kg RA對BALB/c近交系小鼠有較高的致畸率。

本實驗中，在BALB/c近交系小鼠GD10 d管飼50 mg/kg RA誘導胎鼠腭裂畸形在93%以上。大體畸形除腭裂外，主要畸形為短前肢，偶見有短尾發(fā)生。因此，GD10 d，一次性管飼 RA 50 mg/kg，是BALB/c近交系小鼠腭裂形成的理想動物模型。

綜上所述，本次實驗建?；境晒?，成功誘導了胎鼠腭裂，為后續(xù)腭裂形成原因及分子機制的研究提供理想動物模型。

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