佟麗妍史秀麗徐煥鳳馮為民

烏司他丁對(duì)急性腦出血模型兔sTM、vWF及腦組織病理的影響

佟麗妍1史秀麗2徐煥鳳3馮為民1

目的通過對(duì)急性腦出血模型兔動(dòng)脈血可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白（sTM）、血管性假性血友病因子（vWF）以及腦組織標(biāo)本病理變化的觀察，探討烏司他丁（UTI）在急性腦出血中的腦保護(hù)作用。方法 將造模后的30只兔隨機(jī)分為腦出血組、依達(dá)拉奉組、烏司他丁組，每組10只。應(yīng)用ELISA法測定各組兔急性腦出血后動(dòng)脈血sTM、vWF的含量，以及兔腦出血病灶周圍腦組織病理變化。結(jié)果與腦出血組 [sTM 24h：（6.06±0.19）ng/mL，72h：（6.42±0.48）ng/mL；vWF 24h：（10.02±0.71）ng/ mL，72h：（11.39±0.63）ng/mL]比較，依達(dá)拉奉組sTM含量[24h：（4.61±0.11）ng/mL，72h：（4.51±0.10）ng/mL]均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05）；依達(dá)拉奉組vWF含量在72h[（9.64±0.56）ng/mL]時(shí)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05）；烏司他丁組sTM、vWF含量[24h：sTM（4.82±0.77）ng/mL，vWF （9.09±0.24）ng/mL；72h：sTM（4.79±0.75）ng/mL，vWF（8.48±0.73）ng/mL]均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05）。依達(dá)拉奉組與烏司他丁組比較，24h、72h sTM含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＞0.05），24h及72h vWF含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05）。病理結(jié)果提示，烏司他丁組腦出血病灶周圍腦細(xì)胞的線粒體嵴斷裂，胞漿內(nèi)空泡增多，細(xì)胞腫脹方面均比依達(dá)拉奉組延緩。結(jié)論烏司他丁可以降低急性腦出血模型兔血清sTM及vWF含量，以及出血灶周圍腦細(xì)胞線粒體及細(xì)胞核的損害，具有一定的腦保護(hù)作用。

兔；急性腦出血；烏司他丁；可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白；血管性假性血友病因子

腦出血發(fā)病率為每年（60～80）/10萬，在我國約占全部腦卒中的20%～30%，其急性期死亡率為30%～40%[1]。臨床上腦出血后72h以內(nèi)病情變化最劇烈。急性期是導(dǎo)致腦組織損傷最嚴(yán)重的時(shí)期，出血灶周圍腦組織將發(fā)生一系列神經(jīng)細(xì)胞損害變化，可出現(xiàn)腦細(xì)胞線粒體破壞，神經(jīng)細(xì)胞凋亡等，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷。烏司他?。╱linastatin，UTI）是一種具有抑制多種酶、穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜，抑制溶酶體酶的活性及釋放作用的蛋白酶。研究[2]表明，UTI對(duì)腦梗死具有多方面腦保護(hù)作用，并在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中證明有降低可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白（soluble Thrombomodulin，sTM）、血管性假性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）的作用，而后兩者是目前被廣泛作為反映內(nèi)皮細(xì)胞受損的重要標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)旨在探討UTI在急性腦出血后降低sTM、vWF方面的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康成年新西蘭兔，雌雄不限，體質(zhì)量（3.0±0.2）kg，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，許可證號(hào):SCXK（浙）2010-0047。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水，自主進(jìn)食。溫度（23±10）℃，濕度50%～70%，正常晝夜節(jié)律，噪音＜50dB，通風(fēng)，單籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥品及試劑 烏司他丁注射液（規(guī)格:10萬單位/2mL，批號(hào):031301064）產(chǎn)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。兔sTM酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號(hào):Ra00281L）及兔vWF酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號(hào):Ra82321L）均購買自杭州達(dá)文生物有限公司。依達(dá)拉奉注射液產(chǎn)自南京先聲東元制藥有限公司（規(guī)格:10mg/5mL，批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字H20031342）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立與分組 參照文獻(xiàn)[3]方法，并經(jīng)改良后建立動(dòng)物模型:將符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的新西蘭兔，以自體血注入法制作腦出血模型:戊巴比妥鈉（30mg/kg）耳緣靜脈麻醉，頭部剃毛，俯臥位固定于兔腦立體定位儀上。手術(shù)暴露顱骨十字縫和人字縫。參照Sawyer兔腦立體定位圖譜[4]確定內(nèi)囊位置: AP1mm，R6mm，H13mm。選取十字縫交叉點(diǎn)為基點(diǎn)沿冠狀縫向右旁開6mm再平行矢狀縫向前1mm為穿刺進(jìn)針點(diǎn)。在兔耳中央動(dòng)脈采取自體未凝動(dòng)脈血0.5mL，用9號(hào)腰穿針快速垂直于顱骨穿入腦實(shí)質(zhì)，進(jìn)針深度13mm，3min之內(nèi)緩慢注入，停針5min后緩慢拔針。局部壓迫止血，縫合皮膚，造模完成。將造模后的30只新西蘭兔按照隨機(jī)數(shù)字表的方法，平均分為腦出血組、依達(dá)拉奉組、烏司他丁組三組，每組10只。

1.3.2 給藥方案 腦出血組，予生理鹽水2mL，烏司他丁組予UTI注射液1.7萬U/kg（相當(dāng)于成人用藥量3倍劑量）加生理鹽水稀釋為2mL，依達(dá)拉奉組予依達(dá)拉奉注射液3mg/kg（相當(dāng)于成人用藥量3倍劑量）加生理鹽水稀釋為2mL，造模后連續(xù)3天靜脈推注，1天3次。

1.3.3 標(biāo)本采集及檢測指標(biāo) 于造模前（0h），造模后24h、72h，各組動(dòng)物分別采集動(dòng)脈血，離心后收集血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書采用ELISA法檢測血清sTM、vWF的含量。于腦出血組造模后24h，烏司他丁組和依達(dá)拉奉組治療后24h和72h，每組各取2只動(dòng)物，開顱取腦，選取血腫周圍組織約2mm×2mm固定于2.5%戊二醛中，送電鏡標(biāo)本制作及觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（±s） 表示，采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)法，以孕＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組模型兔sTM及vWF變化 造模后各組sTM、vWF均上升。與腦出血組相比，依達(dá)拉奉組24h vWF含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＞0.05），其余各組各時(shí)間點(diǎn)sTM及vWF均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05）；依達(dá)拉奉組與烏司他丁組24h、72h sTM含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＞0.05）；24h、72h vWF含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05）。見表1。

2.2 電鏡結(jié)果 腦出血造模后24h可見細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，凝聚于核膜下，線粒體嵴突模糊，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的早期征象。UTI治療24h可見細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、濃縮，線粒體嵴突模糊，內(nèi)有空泡形成；UTI治療72h細(xì)胞核染色質(zhì)繼續(xù)邊移，線粒體嵴突斷裂，空泡增多，腫脹。依達(dá)拉奉治療24h細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、濃縮，線粒體嵴突斷裂、空泡多，腫脹明顯。依達(dá)拉奉治療72h細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮成堆，出現(xiàn)凋亡晚期征象，線粒體嵴突消失、空泡融合，腫脹明顯，圖1A～5B（插頁）。

表1 各組模型兔sTM及vWF變化（ng/mL，±s）

表1 各組模型兔sTM及vWF變化（ng/mL，±s）

注:與腦出血組比較，▲孕＜0.05；與依達(dá)拉奉組比較，★孕＜0.05；sTM:可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白；vWF:血管性假性血友病因子

組別腦出血組依達(dá)拉奉組烏司他丁組v W F只數(shù)s T M 1 0 1 0 1 0 0 h 4 . 5 3 ± 0 . 2 5 4 . 5 2 ± 0 . 2 2 4 . 5 3 ± 0 . 1 3 2 4 h 6 . 0 6 ± 0 . 1 9 4 . 6 1 ± 0 . 1 1▲4 . 8 2 ± 0 . 7 7▲7 2 h 6 . 4 2 ± 0 . 4 8 4 . 5 1 ± 0 . 1 0▲4 . 7 9 ± 0 . 7 5▲0 h 8 . 3 4 ± 0 . 4 6 8 . 3 2 ± 0 . 4 1 8 . 3 5 ± 0 . 4 7 2 4 h 1 0 . 0 2 ± 0 . 7 1 9 . 7 7 ± 0 . 4 6★9 . 0 9 ± 0 . 2 4▲★7 2 h 1 1 . 3 9 ± 0 . 6 3 9 . 6 4 ± 0 . 5 6▲★8 . 4 8 ± 0 . 7 3▲★

3 討論

腦出血后血腫的壓迫可致局部腦組織缺血缺氧，從而造成腦組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。vWF 及sTM是目前研究較多的得到公認(rèn)的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，可反映內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)。血漿高水平的vWF常伴隨發(fā)生腦卒中的危險(xiǎn)[4]，檢測vWF水平，可作為腦血管疾病急性期內(nèi)皮功能狀態(tài)與受損程度的指標(biāo)。

血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomcdulin，TM）從內(nèi)皮表面水解脫落，成為sTM而游離于血漿中，其水平升高幅度與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度成正比[5]，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)加速斷裂或脫落進(jìn)入血循環(huán)中，依其濃度的變化可以評(píng)估患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及疾病的嚴(yán)重程度，是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)。在張子彥等[6]的研究中，血漿sTM在一定程度上可以反映過敏性紫癜患兒腎臟血管受損情況。而有效組sTM水平治療后較治療前降低。sTM水平變化與治療效果密切相關(guān)。張建江等[7]根據(jù)紫癜性腎炎(HSPN)患兒不同的臨床表現(xiàn)分組比較發(fā)現(xiàn)，sTM在血尿+蛋白尿組明顯升高，表明內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度越重，血尿及蛋白尿越明顯。血管輕度損傷只有血管內(nèi)皮細(xì)胞激活，如血管呈現(xiàn)中度或重度損傷，不僅血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能發(fā)生紊亂，而且出現(xiàn)血管壁結(jié)構(gòu)的破壞。表明在HSPN的發(fā)病過程中血管內(nèi)皮的損傷程度更加嚴(yán)重。同樣，在腦出血后，出血灶周圍腦組織中vWF及sTM含量越高，提示血管損傷越嚴(yán)重，可能導(dǎo)致血腫進(jìn)一步擴(kuò)大，明顯加重病情。并且可能造成血腫周圍的缺血，進(jìn)一步加重血腫周圍正常腦組織的缺血缺氧，甚至形成微梗死。因而，筆者認(rèn)為在腦出血后有效控制血漿vWF及sTM含量，是防治腦出血后腦功能進(jìn)一步惡化的有效方法之一。

依達(dá)拉奉是目前臨床上應(yīng)用最久的自由基清除劑，其具有清除氧自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的作用。依達(dá)拉奉可減輕腦出血后的細(xì)胞凋亡，對(duì)腦出血后神經(jīng)損傷起保護(hù)作用[8]，可以抑制腦細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞）的過氧化作用。體內(nèi)試驗(yàn)顯示，依達(dá)拉奉還能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損害，抑制腦水腫，改善神經(jīng)功能。眾多實(shí)驗(yàn)表明，UTI在保護(hù)血管內(nèi)皮方面，具有與依達(dá)拉奉相近的功能和作用。在UTI對(duì)膿毒癥大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[9]中，UTI組vWF、sTM水平低于模型組（孕＜0.01），高于假手術(shù)組（孕＜0.01），表明UTI對(duì)膿毒癥大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。另一動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[10]，離斷肢體在再植后動(dòng)脈開放前靜脈注射UTI能有效減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度,UTI組的vWF在術(shù)中動(dòng)脈開放0.5小時(shí)較對(duì)照組有明顯的改善。在UTI對(duì)心肺轉(zhuǎn)流（CPB）患者sTM、vWF的影響的臨床研究[11]中，應(yīng)用UTI組患者血漿sTM、vWF水平變化于CPB開始至術(shù)后24h均升高,但觀察組明顯低于對(duì)照組（孕＜0.05），研究發(fā)現(xiàn)，在CPB期間UTI組sTM和vWF較對(duì)照組明顯下降,提示UTI在CPB期間可減少血漿中sTM和vWF含量，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。重癥中暑患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用UTI治療，對(duì)患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[12]。孫家艷等[13]在UTI對(duì)毛細(xì)血管滲漏綜合征（CLS）患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用研究中發(fā)現(xiàn)，UTI組治療后第2天開始sTM及vWF開始下降，至第7天恢復(fù)正常。提示UTI對(duì)CLS患者血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，有良好的臨床療效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示兔腦出血模型建立后，單獨(dú)應(yīng)用依達(dá)拉奉注射液治療，腦出血兔模型的sTM在24h及72h均有明顯下降，vWF在72h下降。而立即給予UTI注射液治療，在24h及72h均可見到vWF 及sTM的下降。病理切片同樣表明，應(yīng)用UTI后腦出血病灶周圍腦細(xì)胞線粒體嵴斷裂、空泡增多、腫脹的變化比應(yīng)用依達(dá)拉奉治療延遲發(fā)生。因而單純應(yīng)用UTI較單純應(yīng)用依達(dá)拉奉在降低腦出血兔模型的sTM及vWF方面的腦保護(hù)作用更加明顯。

綜上所述，UTI可以降低急性腦出血模型兔血清sTM及vWF含量，可以延緩腦出血灶周圍腦細(xì)胞線粒體破壞和細(xì)胞凋亡，具有一定的腦保護(hù)作用。UTI對(duì)于腦出血的腦保護(hù)作用仍需進(jìn)一步深入研究。

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（收稿:2016-03-20 修回:2016-05-12）

Effect of Ulinastatin on sTM and vWF and Tissue Pathology of the Brain of Rabbits with Acute CerebralHemorrhage

TONG Liyan1,SHI Xiuli2,XU Huanfeng3,FENG Weimin1. 1 Department of Neurology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310007),China;2 Eugenics Office,Hebei province Yutian County Family孕l(wèi)anning Center Hospital Tangshan(064100),China;3 Department of Traditional Chinese Medicine,Hebei 孕rovince Shijiazhuang Yangtze River Mental Hospital Shijiazhuang(050000),China

ObjectiveTo observe arterial blood soluble thrombomodulin（sTM）,von Willebrand factor（vWF）and pathological changes of brain tissue specimens in rabbits with acute cerebral hemorrhage after ulinastatin（UTI）intervention,in an attempt to investigate the preventive effect of UTI on the brain.MethodsThirty rabbits successfully modeled were randomly divided into 3 groups：intracerebral hemorrhage（ICH）model group（M group）, edaravone treatment group（Y group）,and UTI treatment group（U group）,with 10 rabbits in each group.ELISA method was used to determine the content of vWF and sTM in the arterial blood and the pathological changes of brain tissues around acute cerebral hemorrhage in the rabbits were observed.ResultsCompared with those of M group[sTM（24h：6.06±0.19 ng/mL,72h：6.42±0.48 ng/mL）;vWF（24h：10.02±0.71 ng/mL,72h：11.39±0.63 ng/mL）],Y group had significantly lower content of sTM at the 24h（4.61±0.11 ng/mL）and 72h（4.51±0.10 ng/ mL,with孕＜0.05 and lower content of vWF at 72h（4.51±0.10 ng/mL）,with孕＜0.05;U group had both reduced contents of sTM and vWF at 24h（sTM：4.82±0.77 ng/mL,vWF：9.09±0.24 ng/mL）and 72h（sTM：4.79±0.75 ng/ mL,vWF：8.48±0.73 ng/mL）,all with signigicant differences（all孕＜0.05）.No significant difference in sTM at both time points was found between Y group and U group（孕＞0.05）,while significant differences in vWF was noted at both time points between the two groups（孕＜0.05）.Pathological results showed that the cells around the lesionof ICH in both U and Y groups appeared mitochondria crista broken and cytoplasmic vacuoles increased and cell swelling,but that those in U group were obviously lighter than those in Y group.Conclusion UTI can reduce serum content of sTM and vWF in acute ICH model rabbit,delay the damage of mitochondria and nucleus of the cells surrounding focal hemorrhage,which indicates that UTI has a certain brain protective effect.

rabbit;acute cerebral hemorrhage;ulinastatin;sTM;vWF

浙江省中醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃研究項(xiàng)目（No.2014ZB091）；天普科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（No.01200919）

1杭州市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（杭州 310007）；2河北省玉田縣計(jì)生中心醫(yī)院優(yōu)生辦公室（唐山 064100）；3河北省石家莊長江心理醫(yī)院中醫(yī)科（石家莊 050000）

佟麗妍，Tel:18905810196；E-mail:tong06315@163.com