金 照陳智耶袁玉青鄭艷艷王 辰金可可

復(fù)方大黃膏抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

金 照1陳智耶1袁玉青1鄭艷艷1王 辰1金可可2

小鼠；復(fù)方大黃膏；抗炎；鎮(zhèn)痛；炎癥介質(zhì)

復(fù)方大黃膏為肛腸科外用藥,具有止痛、消腫、止血等功效。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該藥物的抗炎鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制進(jìn)行研究，并與馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏作對(duì)照，為進(jìn)一步開發(fā)該藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 動(dòng) 物 選用8周齡健康雄性ICR小鼠，合格證書:SYXK（浙）2015-0009，體質(zhì)量（25±5）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，給予顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥品和試劑 復(fù)方大黃膏成分為大黃、白芨、三七、甘草，由溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥制劑室制備。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β （IL-1β）Ⅰ抗購自Santa Cruz，Ⅱ抗購自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司，其它試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

2 方 法

2.1 消腫實(shí)驗(yàn) 采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法。雄性50只隨機(jī)均分為復(fù)方大黃膏高、中、低劑量組（分別以5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg的藥物外用）、馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏組（2.5g/kg）、賦形劑對(duì)照組（復(fù)方大黃膏賦形劑凡士林2.5g/kg）。二甲苯0.05mL均勻涂于小鼠右耳前、后兩面致炎，1h后各實(shí)驗(yàn)組小鼠致炎耳廓上再分別均勻涂以相應(yīng)藥物或賦形劑，4h后將小鼠頸椎脫位致死，沿耳廓基線用直徑8mm打孔器在左右兩耳同一部位打下雙耳片，分析天平上稱重，求兩耳片重量之差。按以下公式計(jì)算腫脹度和抑制率:腫脹度（%）=（右耳重-左耳重）/左耳重×100%，抑制率（%）=［（對(duì)照組腫脹度均數(shù)-用藥組腫脹度均數(shù)）/對(duì)照組腫脹度均數(shù)］×100%。

2.2 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 采用熱板法及醋酸扭體法。熱板法:恒溫器水溫調(diào)節(jié)至（55±0.5）℃，將500mL燒杯放入其中，燒杯底部接觸水面。每次取小鼠1只，放入燒杯內(nèi)。記錄自放入燒杯至出現(xiàn)舔后腳所需時(shí)間（s），作為該鼠的痛閾值。如30s內(nèi)不出現(xiàn)舔后足者，則棄之不用。依次測(cè)量各小鼠的痛閾值，預(yù)選合格小鼠100只，隨機(jī)分為五組，組別同消腫實(shí)驗(yàn)，重新測(cè)痛閾1次。將兩次痛閾的平均值作為該鼠給藥前的痛閾值。然后各組均灌胃給藥（劑量同消腫實(shí)驗(yàn)），給藥后30、60、120min分別測(cè)定各小鼠痛閾值。若60s仍無反應(yīng)，即取出，其痛閾按60s計(jì)算。醋酸扭體法:動(dòng)物、分組、給藥同熱板法。取0.6%醋酸溶液，按0.1mL/10g劑量，腹腔注射，觀察15min內(nèi)各動(dòng)物出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)。

2.3 抗炎實(shí)驗(yàn) 采用蛋白印跡法（Western blotting）檢測(cè)組織腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）蛋白的表達(dá)。取上述2.1中各組的右耳組織于-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ?xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1h，Ⅰ抗4℃孵育過夜。Ⅱ抗室溫孵育2h后ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行蛋白定量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，用（±s）表示。多組樣本均數(shù)比較采用方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者則進(jìn)行Dunnet’s T3檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 與賦形劑對(duì)照組比較，復(fù)方大黃膏低、中、高劑量組耳腫脹度均顯著減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05或孕＜0.01），抑制率以高劑量組最為明顯，顯示良好的量效關(guān)系，見表1。

表1 復(fù)方大黃膏對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹度的影響（%，±s）

表1 復(fù)方大黃膏對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹度的影響（%，±s）

注:與賦形劑對(duì)照組比較，*孕＜0.05，**孕＜0.01

組別賦形劑對(duì)照組復(fù)方大黃膏低劑量組復(fù)方大黃膏中劑量組復(fù)方大黃膏高劑量組馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏組鼠數(shù)10 10 10 10 10腫脹度111.24±20.21 88.45±19.31* 80.33±16.41** 71.91±13.29** 81.70±15.52**抑制率0 20.49 27.79 35.36 26.56

3.2 對(duì)小鼠熱板法致痛和醋酸扭體反應(yīng)的影響 熱板法結(jié)果顯示，與賦形劑對(duì)照組比較，復(fù)方大黃膏中、高劑量組均明顯提高用藥后30、60、120min小鼠的痛閾值，復(fù)方大黃膏低劑量組可明顯提高用藥后30、60min小鼠的痛閾值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05），見表2。醋酸扭體法結(jié)果顯示，與賦形劑對(duì)照組的（32.46±7.64）次比較，復(fù)方大黃膏中、高劑量組扭體次數(shù)分別為（19.48±6.02）次、（15.22±6.60）次，均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.01）。提示復(fù)方大黃膏具有良好的鎮(zhèn)痛作用。

3.3 對(duì) TNF-α和 IL-1β表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示，與賦形劑對(duì)照組比較，復(fù)方大黃膏低、中、高劑量組TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)均明顯降低（孕＜0.05），且高劑量組與低、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（孕＜0.05），見圖1。提示復(fù)方大黃膏對(duì)炎癥介質(zhì)表達(dá)具有明顯的抑制作用。

表2 復(fù)方大黃膏對(duì)小鼠熱板致痛作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果（s±s）

表2 復(fù)方大黃膏對(duì)小鼠熱板致痛作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果（s±s）

注:與賦形劑對(duì)照組比較，*孕＜0.05

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4 討論

由于肛門部解剖學(xué)和生理學(xué)特點(diǎn)決定肛門部疾病容易感染，發(fā)作時(shí)疼痛明顯，術(shù)后愈合的時(shí)間長(zhǎng)。細(xì)菌及細(xì)菌釋放內(nèi)毒素的作用是引起創(chuàng)面愈合延緩的主要因素，內(nèi)毒素不但引起創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤，還可引起炎性細(xì)胞因子釋放，從而加重局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致創(chuàng)面水腫，并形成水腫肉芽，減少成纖維細(xì)胞增生及向膠原纖維轉(zhuǎn)化。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)之一，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放[1]；IL-1β是急性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，是啟動(dòng)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一[2]。復(fù)方大黃膏主要成分為大黃、白芨、三七、甘草，按照7：3：2：1配制。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方大黃膏低、中、高三個(gè)劑量組對(duì)二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用，均明顯抑制TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)。提示復(fù)方大黃膏可通過抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。

圖1 復(fù)方大黃膏對(duì)小鼠腫脹耳廓TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)的影響

熱板法結(jié)果顯示，復(fù)方大黃膏中、高劑量組均明顯提高用藥后30、60、120min小鼠的痛閾值，低劑量組可明顯提高用藥后30、60min小鼠的痛閾值，中、高劑量能明顯減少小鼠扭體次數(shù)，表明該藥對(duì)化學(xué)和物理刺激造成的疼痛反應(yīng)均有明顯的鎮(zhèn)痛效果。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)與疼痛反應(yīng)有密切關(guān)系，炎癥反應(yīng)使血管通透性增高，血液成分進(jìn)入組織中，組織中的感覺神經(jīng)受到炎癥因子的刺激，可發(fā)生疼痛反應(yīng)[3]。因此，本研究中復(fù)方大黃膏緩解疼痛的作用可能也與抑制TNF-α和IL-1β等炎癥介質(zhì)的釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

［1］Vandenbroucke RE，Dejonckheere E，Van Hauwermeiren F，et al.Matrix metalloproteinase 13 modulates intestinal epithelial barrier integrity in inflammatory diseases by activating TNF［J］.EMBO Mol Med，2013，5（7）:932-948.

［2］師偉，劉瑞芬，楊曉娜，等.活血化瘀法對(duì)慢性盆腔炎雌性大鼠血清前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影響［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（32）:1-3.

［3］Esfahani HM，Esfahani ZN，Dehaghi NK，et al.Anti-inflammatory and anti-nociceptive effects of the ethanolic extracts of Alkanna frigida and Alkanna orientalis［J］.J Nat Med，2012，66（3）:447-452.

（收稿:2016-03-24 修回:2016-05-31）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.Y207495）；浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.Y20130315）

1浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中醫(yī)肛腸科（溫州 325000）；2溫州醫(yī)科大學(xué)（溫州 325000）

金可可，Tel:13868306996