王曉磊余道軍侯曉麗

蟾酥逆轉(zhuǎn)多重耐藥鮑曼不動桿菌氨基糖苷類耐藥研究

王曉磊1余道軍1侯曉麗2

蟾酥；鮑曼不動桿菌；氨基糖苷類；多重耐藥；RT-PCR

鮑曼不動桿菌（acinetobacter baumannii，AB）是生存能力較強的非發(fā)酵條件致病菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中，是院內(nèi)感染的主要病原菌。隨著目前醫(yī)院廣譜抗菌藥物、各類免疫抑制劑的廣泛使用及各種介入治療的普及，導(dǎo)致鮑曼不動桿菌的耐藥率逐年增高。近幾年中國CHINET耐藥性監(jiān)測中均發(fā)現(xiàn)，多重耐藥鮑曼不動桿菌無論是在耐藥菌中所占的比例或?qū)εR床常見的抗菌藥物的耐藥率，均呈逐年上升的趨勢[1-3]。

中藥蟾酥具有強心、升壓、鎮(zhèn)痛以及抗腫瘤等多種藥理活性,但成分復(fù)雜。本實驗通過研究兩種蟾酥制劑作用不同時間，對多重耐藥鮑曼不動桿菌氨基糖苷類抗菌藥物相關(guān)耐藥基因表達(dá)的影響，從基因表達(dá)調(diào)控角度探討蟾酥作用時間對鮑曼不動桿菌氨基糖苷類耐藥性的影響及其部分機制。

1 實驗材料

1.1 菌株來源 收集2014年1月—2015年4月期間來我院就診的患者痰、血液、傷口分泌物及膽汁等標(biāo)本，分離得到非重復(fù)100株鮑曼不動桿菌。并通過瓊脂稀釋法檢測蟾酥和氨基糖苷類抗菌藥物單獨及聯(lián)合使用獲得最低抑菌濃度（minimum inhibitory con-centration，MIC），篩選2株菌株用于耐藥基因表達(dá)實驗。

1.2 藥物與儀器 蟾酥（購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部）；熒光定量PCR分析儀（ABI7500熒光定量PCR分析儀）；生物安全柜（新加坡ESCO公司生產(chǎn)，型號AC2-4S1）；高速冰凍離心機（德國賽默飛生產(chǎn)，型號Thermo Micro 17R型）。

1.3 主要試劑 細(xì)菌總RNA提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公，批號3140309-02HW）。一步法SYBGREEN RT-PCR試劑（TaKaRa公司,批號804051）。滅菌注射用水（浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，批號20150818）。無水乙醇（杭州龍山精細(xì)化工有限公司，批號20150726）。

2 實驗方法

2.1 蟾酥有效成分提取 （1）醇提蟾酥:稱取片狀蟾酥0.5g，充分研磨，加入50mL無水乙醇，放置在37℃恒溫振蕩器，100～110Rmp/min振蕩48h，分裝到15mL離心管中，3000Rmp/min，離心10min，取上清液，用濾紙將上清液過濾,將過濾液用0.2μm的除菌濾器再次過濾除菌,用無水乙醇定容至100mL,蟾酥濃度記為5mg/mL。保存在無菌的Eppendorf管中，置4℃冰箱備用；（2）水提蟾酥:稱取片狀蟾酥0.5g，充分研磨，加入50mL蒸餾水，放置在37℃恒溫振蕩器，100～110Rmp/min振蕩48h，分裝到15mL離心管中，3000Rmp/min，離心10min，取上清液，用濾紙將上清液過濾，將過濾液分裝至1.5mL Eppendorf管中。取上述已分裝的上清液，12 000Rmp/min，離心10min后，再用0.2μm的除菌濾器過濾除菌，用無菌注射用水定容至100mL，蟾酥濃度記為5mg/mL。保存在無菌的Eppendorf管中，置4℃冰箱備用。

2.2 實驗菌株配置 通過先期實驗，根據(jù)瓊脂稀釋法檢測蟾酥和氨基糖苷類抗菌藥物單獨及聯(lián)合使用時，最低抑菌濃度的變化情況，篩選出2株具有協(xié)同抗菌作用的菌株用于耐藥基因表達(dá)實驗，菌株編號為32和34。菌株重新純培養(yǎng)，將培養(yǎng)的菌株配成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏幕鞈乙?，并用營養(yǎng)肉湯稀釋100倍，備用。醇提蟾酥和水提蟾酥配置:將醇提、水提蟾酥分別用營養(yǎng)肉湯稀釋，濃度為32、34號菌株的0.5MIC濃度。吸取稀釋好的菌液100μL，分別加到醇提蟾酥和水提蟾酥中（細(xì)菌終濃度105CFU/mL），同時記錄時間。分別作用0、0.5、1、2、4、8、16、24和48h后提取菌株的RNA。

2.3 RNA純度及含量檢測 RNA提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。取RNA液1μL，在微量核酸檢測儀上檢測其純度（得到OD260/OD280為1.9），然后采用電泳法半定量其含量。

2.4 引物合成 根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)設(shè)計引物，并委托上海生工生物有限公司合成。見表1。

2.5 反應(yīng)體系 2×one stop SYBR Green Mix 10μL、one stop SYBR Green Mix 1μL、Dye 2 0.4μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4μL、ddH2O 3.8μL和RNA模板4μL，共計20μL。

2.6 反應(yīng)條件 按照TaKaRa試劑公司的說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為50℃30min，95℃5min，95℃10s，60℃40s，其中95℃10s和60℃40s循環(huán)40次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件對兩種蟾酥制劑對氨基糖苷類耐藥基因表達(dá)影響的結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗比較，以孕＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物合成表

3 結(jié)果

兩種蟾酥提取液分別與鮑曼不動桿菌菌株作用不同時間，醇提蟾酥作用后的CT值普遍高于水提蟾酥作用，顯示醇提蟾酥抑制耐藥基因表達(dá)作用強于水提蟾酥。兩種蟾酥提取液對鮑曼不動桿菌氨基糖苷類耐藥基因表達(dá)影響，醇提蟾酥作用16、24h后，氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ⅱ和aac（6'）-Ⅰ基因的表達(dá)水平均有不同程度下降，48h左右抑制作用減弱。水提蟾酥抑制耐藥基因的作用弱于醇提蟾酥，僅在4h對aac（6'）-Ⅱ有抑制作用，但維持時間短，并逐漸減弱，對aac（6'）-Ⅰ則基本無抑制作用，僅24h時有較弱的抑制作用。蟾酥對氨基糖苷類耐藥基因ant（3〞）-Ⅰ基因整體抑制效果不佳，醇提蟾酥作用16h時對ant（3〞）-Ⅰ表達(dá)有微弱抑制作用，隨后逐漸減弱。而水提蟾酥基本無抑制ant（3〞）-Ⅰ表達(dá)作用。兩種蟾酥制劑對AMI-aphA1和AMIaadA1作用效果基本一致，醇提蟾酥作用16～24h時對這兩種基因表達(dá)有較明顯的抑制作用，但維持時間短。水提蟾酥對這兩種基因的抑制作用較弱。蟾酥作用48h時，以上基因的RT-PCR結(jié)果顯示均有較為明顯的CT值下降。醇提蟾酥作用16和24小時對五種基因的表達(dá)與作用與其他時間段比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（孕＜0.05）。水提蟾酥作用0、0.5、1和2小時對五種基因的表達(dá)與作用與其他時間段比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（孕＜0.05），見表2～5。

4 討 論

隨著抗生素尤其是廣譜抗生素的大量應(yīng)用，臨床上多重耐藥鮑曼不動桿菌的分離率越來越高[4-5]，給臨床抗感染治療帶來極大困擾。臨床上多藥聯(lián)合應(yīng)用容易產(chǎn)生更強的耐藥菌株[6]。研究[7-10]表明，某些中藥與抗菌藥物聯(lián)用可以產(chǎn)生顯著的增效作用，因此中藥與抗菌藥物聯(lián)用成為新的研究熱點。

蟾酥為中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺的分泌物，干燥后可以入藥。余道軍等[11]研究發(fā)現(xiàn)蟾酥的水提和醇提液均可以使大腸桿菌的耐藥基因TEM和CTX-M-9的mRNA表達(dá)喪失，從耐藥表型的研究表明其逆轉(zhuǎn)了大腸桿菌的對相關(guān)抗菌藥的耐藥性。說明中藥不僅有良好的抗菌作用，其在恢復(fù)已

經(jīng)耐藥的細(xì)菌對相關(guān)抗菌藥物敏感性方面也有良好的效果。任玲玲等[12-13]和游思湘[14]的相關(guān)研究顯示，中藥可以改變耐藥菌的基因序列，抑制其耐藥性，降低對某一類抗菌藥物的耐藥性。

表2 32號菌株醇提蟾酥作用后氨基糖苷類耐藥基因表達(dá)結(jié)果（CT值）

表3 32號菌株水提蟾酥作用后氨基糖苷類耐藥基因表達(dá)結(jié)果（CT值）

表4 34號菌株醇提蟾酥作用后氨基糖苷類耐藥基因表達(dá)結(jié)果（CT值）

表5 34號菌株水提蟾酥作用后氨基糖苷類耐藥基因表達(dá)結(jié)果（CT值）

本研究通過RT-PCR檢測多重耐藥鮑曼不動桿菌氨基糖苷類藥物耐藥基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)醇提蟾酥作用0～8h，aac（6'）-Ⅱ和aac（6'）-Ⅰ的表達(dá)沒有被明顯抑制，當(dāng)作用16～24h后，aac（6'）-Ⅱ和aac （6'）-Ⅰ基因的表達(dá)水平均有不同程度下降，說明醇蟾酥抑制基因表達(dá)的作用可能有一定的累加效應(yīng)。醇提蟾酥的抑制作用在48h左右又減弱，可能是由于醇提蟾酥有效成分降解變化所致。水提蟾酥抑制耐藥基因的作用弱于醇提蟾酥，對aac（6'）-Ⅱ在4h左右有抑制作用，但維持時間短，8h后已基本無作用，對aac（6'）-Ⅰ則基本無抑制作用，只在24h時有較弱的抑制作用。

本研究顯示，蟾酥對核苷轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)基因ant （3〞）-Ⅰ表達(dá)的整體抑制效果不佳。RT-PCR檢測顯示，醇提蟾酥在作用16h左右時有微弱的抑制核苷轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)基因ant（3〞）-Ⅰ表達(dá)的作用，隨后即逐漸減弱，而水提蟾酥基本沒有抑制ant（3〞）-Ⅰ表達(dá)的作用。所以我們推測，本次研究的鮑曼不動桿菌耐藥與核苷轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)關(guān)系不是很密切。

蟾酥對AMI-aphA1和AMIaadA1基因作用的結(jié)果顯示，兩種蟾酥制劑的作用效果基本一致。醇提蟾酥在作用1h時有較明顯的抑制這兩種基因表達(dá)的作用，但維持時間短，2h后基本無抑制作用。造成這種現(xiàn)象的機制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。水提蟾酥對這兩種基因在2h時有較弱的抑制作用，2h后也基本無抑制作用。蟾酥作用48h時，上述基因的RT-PCR結(jié)果顯示均有較為明顯的CT值下降，基因表達(dá)重新活躍，原因可能與蟾酥的有效成分降解或代謝有關(guān)。

綜上所述，蟾酥有抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌氨基糖苷類藥物耐藥基因表達(dá)的作用，這種作用的強弱程度與蟾酥作用時間有一定的關(guān)系，且在不同的基因會有不同的表現(xiàn)。從總體抑制基因表達(dá)效果分析，醇提蟾酥在16h和24h時抑制基因表達(dá)的效果明顯，而水提蟾酥則在前2h效果較明顯，推測可能和不同蟾酥制劑的有效成分不用，發(fā)揮作用的時間有關(guān)。通過對抑制基因表達(dá)結(jié)果的分析，說明蟾酥可能有逆轉(zhuǎn)細(xì)菌氨基糖苷類耐藥性的作用。但中藥逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的機制尚沒有權(quán)威的解釋。我們通過本次的初步研究，認(rèn)為蟾酥逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的機制之一可能是抑制細(xì)菌耐藥基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而使耐藥酶無法表達(dá)而喪失耐藥性。為進(jìn)一步深入研究中藥制劑逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥研究提供新思路。

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（收稿:2016-05-13 修回:2016-06-14）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第一醫(yī)院檢驗科（杭州 310007）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）

王曉磊，Tel:18267112102；E-mail:32419641@qq.com