趙孟孟，馮麗麗，張二芹，馬紅芳，馮松林，崔甜甜，楊春輝，王文佳，邢 星，張 雅，馮嘉萍，張桂紅*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002； 4.河南省舞陽縣畜牧局，河南 舞陽 462400； 5.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 鄭州 450046； 6.廣西欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西 欽州 535008)

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豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP9蛋白的亞細(xì)胞定位與功能預(yù)測

趙孟孟1，2，馮麗麗3，張二芹1，馬紅芳1，馮松林2，崔甜甜2，楊春輝4，王文佳5，邢 星6，張 雅1，馮嘉萍2，張桂紅2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002； 4.河南省舞陽縣畜牧局，河南 舞陽 462400； 5.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 鄭州 450046； 6.廣西欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西 欽州 535008)

為了研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)非結(jié)構(gòu)蛋白9(NSP9)的亞細(xì)胞定位，并探索NSP9蛋白在PRRSV復(fù)制過程中的定位變化，首先預(yù)測NSP9蛋白的生物信息學(xué)功能，之后將含有NSP9基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，并接種PRRSV，通過間接免疫熒光方法檢測NSP9蛋白的表達(dá)與定位情況。功能預(yù)測結(jié)果表明，NSP9蛋白內(nèi)部存在雙向核定位序列、酰胺化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、伸展蛋白重復(fù)區(qū)域、RNA聚合酶結(jié)合區(qū)域。間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示，PRRSV感染之初，NSP9蛋白定位在Marc-145細(xì)胞質(zhì)中，圍繞在細(xì)胞核附近，隨PRRSV感染時間延長，其逐步往細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的面積也逐步增多?？梢姡琍RRSV感染會引起NSP9蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒； NSP9蛋白； 真核表達(dá)； 亞細(xì)胞定位

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種引起母豬繁殖障礙和各年齡豬呼吸道癥狀的高度傳染性、接觸性傳染病。該病呈世界范圍流行，在我國1995年被首次報(bào)道[1]，2006年大面積暴發(fā)[2]，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，編碼10個開放閱讀框，包括ORFla、ORFlb、ORF2—ORF7和ORF2a、ORF5a，ORF1a和ORF1b基因約占病毒基因組的80%，均參與病毒復(fù)制，其中ORF1b包括編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)的NSP9基因，RdRp是RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的引擎，其主要功能是在病毒合成RNA的過程中，結(jié)合底物參與RNA的合成[3]，并且此酶只在病毒復(fù)制時出現(xiàn)，這對PRRS的診斷有重大意義[4]。有報(bào)道該蛋白和病毒毒力密切相關(guān)[5]，針對NSP9蛋白及其致病分子機(jī)制等方面的研究已成為新的研究熱點(diǎn)。

許多RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面已日趨完善[6]，相比之下，非結(jié)構(gòu)蛋白方面的研究較少，存在許多未知問題，在這些非結(jié)構(gòu)蛋白中，病毒自身編碼的RdRp對病毒的復(fù)制起關(guān)鍵作用。對RdRp進(jìn)行研究可以使RNA病毒復(fù)制機(jī)制得到進(jìn)一步闡明，并為研制新的抗病毒靶標(biāo)和診斷試劑提供可能。NSP9蛋白在PRRSV發(fā)生中的具體作用尚不清楚，基于該蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和治療策略還在尋求之中。PRRSV的NSP9蛋白主要由ORF1b編碼，保守性很高[7-8]，宿主蛋白膜聯(lián)蛋白A2、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白、DEAD-box RNA解旋酶與該蛋白相互作用促進(jìn)PRRSV復(fù)制[9-13]，因而，將NSP9蛋白作為診斷抗原鑒別PRRSV感染具有重大意義[14-19]。有報(bào)道可以在體外獲取有活性的與PRRSV同科的馬動脈炎病毒(EAV)的NSP9蛋白，并且該蛋白可以從頭起始RNA的復(fù)制[20]。另有報(bào)道，NSP9蛋白可以誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ和IL-10[21-22]。

NSP9蛋白和宿主蛋白互相作用，促進(jìn)病毒復(fù)制，抑制該蛋白會抑制病毒的復(fù)制，但是PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP9在病毒復(fù)制過程中的具體作用缺乏相應(yīng)研究，NSP9的亞細(xì)胞定位以及病毒感染對NSP9的影響尚未見報(bào)道。為此，本研究采用生物信息學(xué)對NSP9蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測，并對其亞細(xì)胞定位進(jìn)行探究，旨在為PRRSV致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞和培養(yǎng)基 Marc-145細(xì)胞由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生物科技有限公司(北京)，pIRES2-EGFP-NSP9質(zhì)粒由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、4%多聚甲醛、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自天根生化科技(北京)有限公司，裂解液RIPA購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。PRRSV NSP9蛋白單克隆抗體由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，羅丹明(Rhodamine)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，脫脂奶粉購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 NSP9的核定位、核輸出信號、結(jié)構(gòu)功能域分析 利用信息學(xué)分析網(wǎng)站http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_y.cgi預(yù)測NSP9蛋白的核定位序列，http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/預(yù)測其核輸出序列， http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan預(yù)測其功能域。

1.2.2 pIRES2-EGFP-NSP9質(zhì)粒的抽提、轉(zhuǎn)染 將pIRES2-EGFP-NSP9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌液PCR篩選出陽性克隆，送往上海立菲生物科技有限公司測序。序列測定為陽性的菌液，參照OMEGA去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒的說明書進(jìn)行去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒的抽提。

Marc-145細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長至60%左右，用Invitrogen公司的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Western blot鑒定 轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞樣品棄去上清，之后用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳結(jié)束后采用半干轉(zhuǎn)膜方法，在15 V電壓下轉(zhuǎn)移60 min， 5%脫脂奶粉封閉1 h，NSP9蛋白單克隆抗體(1∶500稀釋)孵育過夜，加入用TBST緩沖液(TBS+0.2%Tween-20)按1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠 IgG孵育1 h，之后ECL化學(xué)發(fā)光拍照記錄。

1.2.4 間接免疫熒光(IFA)鑒定NSP9在細(xì)胞中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后的 Marc-145細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，經(jīng)觀察可用作IFA檢測。每孔加入200 μL的4%多聚甲醛固定，加入100 μL 0.25%的Triton X-100，用5%的脫脂牛奶封閉1 h，每孔加200 μL按1∶500倍稀釋的PRRSV NSP9蛋白的單克隆抗體，孵育后每孔加入200 μL按1∶100稀釋的羅丹明標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，DAPI染色5 min,最后置于免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 PRRSV感染對NSP9蛋白在Marc-145細(xì)胞中定位的影響 待Marc-145細(xì)胞長至60%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后以MOI為1的病毒劑量接毒，分別在接毒之后6 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，方法參照1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

核定位分析表明，有3段序列可以在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭，分別為RLVRKYLFAHVGKCPPVHRPSTYPAKNSMA、VTKRGGLSSGDPITSVSNTIYSLVIYAQH、YFKSGHPHGLLFLQDQLKFEDMLKVQPLI。核輸出序列預(yù)測結(jié)果表明無核輸出序列。功能預(yù)測結(jié)果表明，NSP9蛋白內(nèi)部存在雙向核定位序列、酰胺化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)、酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、伸展蛋白重復(fù)區(qū)域、RNA聚合酶結(jié)合區(qū)域。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NSP9 在Marc-145細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果

將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生長狀況良好的Marc-145細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡觀察，綠色熒光非常明顯，表明轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒得到了穩(wěn)定的表達(dá)(圖1)。

圖1 pIRES2-EGFP-NSP9轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果

將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的Marc-145細(xì)胞進(jìn)行裂解，經(jīng)Western blot鑒定，結(jié)果表明，在近90 ku處出現(xiàn)目的蛋白，與預(yù)期一致，說明NSP9蛋白得到了正確表達(dá)(圖2)。

M.蛋白質(zhì)Marker； 1.pIRES2-EGFP-NSP9轉(zhuǎn)染結(jié)果;2.pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染結(jié)果

將轉(zhuǎn)染48 h后的Marc-145細(xì)胞經(jīng)過IFA檢測，可觀察到較強(qiáng)的紅色熒光，其代表表達(dá)在細(xì)胞上的NSP9蛋白，根據(jù)細(xì)胞核位置與紅色熒光的相對位置，NSP9蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖3)。

A.NSP9蛋白； B.DAPI染色； C.疊加

2.3 PRRSV感染后NSP9位置的變化

從圖4可以看出，初始NSP9蛋白處于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，圍繞細(xì)胞核。PRRSV感染后，隨著時間的推移，NSP9蛋白逐步往細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的面積也逐步增多。

A.NSP9蛋白； B.DAPI染色； C.疊加

3 結(jié)論與討論

通常病毒結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白的提取較為困難，因此，將外源基因插入真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞成為表達(dá)此類蛋白質(zhì)比較有效的方法之一。本研究利用pIRES2-EGFP載體表達(dá)NSP9蛋白，間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，NSP9蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核未見表達(dá)，這與軟件預(yù)測結(jié)果保持一致。病毒感染細(xì)胞之后，隨著病毒復(fù)制，NSP9蛋白逐步往細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移，并且轉(zhuǎn)移面積逐步增多。往細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的原因，可能是病毒在細(xì)胞核內(nèi)組裝，NSP9蛋白參與病毒的組裝與成熟，在胞漿和胞核之間充當(dāng)運(yùn)輸載體及進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。NSP9蛋白在胞漿和胞核之間介導(dǎo)通路的調(diào)控中是否扮演不同的角色還需驗(yàn)證，軟件預(yù)測NSP9蛋白含有雙向核定位序列，可能是這些序列介導(dǎo)病毒感染之后進(jìn)入細(xì)胞核，本試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了軟件預(yù)測結(jié)果。NSP9蛋白入核之后如何調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的變化，是否引起各個通路的變化，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以及細(xì)胞核內(nèi)如何與宿主蛋白相互作用，均需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，NSP9蛋白入核前后如何調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)是否與病毒逃逸免疫系統(tǒng)以及病毒的毒力相關(guān)都是下一步要解決的問題。軟件預(yù)測結(jié)果表明，NSP9蛋白存在一些核定位序列，其是否參與免疫調(diào)節(jié)，以及是否與毒力相關(guān)也是需要研究解決的問題。

本研究結(jié)果為NSP9蛋白參與病毒復(fù)制研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，填補(bǔ)該研究的未知領(lǐng)域，為抗病毒藥物研發(fā)及受體相互作用研究提供新的思路和線索[23-26]，為下一步研究NSP9蛋白在病毒復(fù)制過程中的位置變化所帶來的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化、探索該蛋白的免疫調(diào)控機(jī)制以及該蛋白與病毒毒力關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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Subcellular Localization Analysis and Function Prediction of PRRSV NSP9 Protein

ZHAO Mengmeng1，2,FENG Lili3,ZHANG Erqin1,MA Hongfang1,FENG Songlin2,CUI Tiantian2,YANG Chunhui4,WANG Wenjia5,XING Xing6,ZHANG Ya1,FENG Jiaping2,ZHANG Guihong2*

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province/National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry/College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;3.Institute of Agricultural Economics and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;4.Wuyang County Animal Husbandry Bureau,Wuyang 462400,China; 5.School of Pharmaceutical Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China; 6.Guangxi Qinzhou Free Trade Port Area Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qinzhou 535008,China)

This study aimed to confirm the subcellular localization of NSP9 protein and verify whether PRRSV infection could affect its localization.The biological characters was predicted by softwares.Plasmids containingNSP9 gene were transfected into Marc-145 cells,and Marc-145 cells were infected with PRRSV. Indirect immunofluorescence assay(IFA) was used to detect its localization.The results of functional prediction showed that NSP9 protein had two-way nuclear localization sequence,amidation site,a casein kinase phosphorylation site,N-glycosylation site,N-myristoylation site,protein kinase C phosphorylation site,a cell binding site,a tyrosine kinase phosphorylation site,a stretch protein repeat region,and an RNA polymerase binding domain.The results of IFA showed that NSP9 protein was located in the cytoplasm in Marc-145 cells.After PRRSV infection,NSP9 protein gradually transfer to the nucleus,and the area also gradually increased.It demonstrated that PRRSV infection changed the localization of NSP9 protein.

PRRSV; NSP9 protein; eukaryotic expression； subcellular localization

2016-07-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272564)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203039)；國家生豬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-36)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2016YFD0500707)

趙孟孟(1986-)，男，河南汝州人，在讀博士研究生，研究方向：豬繁殖與呼吸綜合征病毒的致病機(jī)制。 E-mail: zhaomengmeng502@163.com

*通訊作者：張桂紅(1968-)，女，黑龍江哈爾濱人，教授，博士，主要從事動物傳染病研究。

時間：2016-11-25 14:24:33

S855.3

A

1004-3268(2016)12-0138-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.032.html