劉 輝，田亞紅，劉子艷，李亞子

(1.唐山工業(yè)職業(yè)技術學院，河北 唐山063229； 2.華北理工大學 生命科學學院，河北 唐山 063000)

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酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈生產蛋白飼料的研究

劉 輝1，田亞紅2，劉子艷1，李亞子2

(1.唐山工業(yè)職業(yè)技術學院，河北 唐山063229； 2.華北理工大學 生命科學學院，河北 唐山 063000)

為提高玉米秸稈飼料的營養(yǎng)價值，首先，通過添加不同發(fā)酵劑確定最佳發(fā)酵劑為纖維素酶和酵母菌混合物；然后，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈生產蛋白飼料的工藝，考察了發(fā)酵時間、酶菌比例、料液比和發(fā)酵溫度對玉米秸稈發(fā)酵飼料粗蛋白含量的影響。結果表明，最佳工藝條件為：發(fā)酵時間48 h，酶菌混合比例8︰15，料液比1︰20，溫度35 ℃。在此條件下，發(fā)酵產品的粗蛋白含量達29.71 %，較發(fā)酵前提高4.67倍。

玉米秸稈； 纖維素酶； 酵母菌； 發(fā)酵； 蛋白飼料

玉米是我國主要農作物之一，在我國北方大面積種植，每年都會產生大量的玉米秸稈，年產量約為2.4億t[1]。由于其粗纖維含量較高，動物消化吸收率低，營養(yǎng)成分減少，適口性降低。除少部分被用作家畜的粗飼料和秸稈還田作肥外，其余秸稈均被焚燒廢棄，利用率不足10%，這樣既造成了天然資源的巨大浪費，也污染了環(huán)境[2-4]。因此，如何提高玉米秸稈飼料的適口性、利用率和消化率，降低其對環(huán)境的污染，成為亟待解決的問題。

玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素、木質素等成分組成，并共存于植物纖維原料中。由于結構復雜，嚴重阻礙了酶解的進行。目前，國內外學者對玉米秸稈發(fā)酵飼料進行了廣泛研究，主要集中在不同預處理方法的研究[5-6]、纖維素酶降解條件的優(yōu)化[7-8]以及多菌種發(fā)酵生產蛋白飼料[9-10]等方面，在秸稈降解方面取得了一定的效果，然而粗蛋白含量仍較低。為提高玉米秸稈發(fā)酵飼料的粗蛋白含量，利用纖維素酶和酵母菌種共同發(fā)酵玉米秸稈，發(fā)揮酶、菌的相互作用，并研究酶菌協(xié)同發(fā)酵生產蛋白飼料的影響因素，以期為利用玉米秸稈生產蛋白飼料提供一種新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料 玉米秸稈取自唐山市某大田，粉碎過841 μm篩，備用。

1.1.2 菌種和酶 安琪酵母(釀酒曲)、纖維素酶由華北理工大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.3 主要儀器 722型可見光分光光度計購自上海光譜儀器有限公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱購自天津市泰斯特儀器有限公司；DNP-902電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實驗設備有限公司；YXQ-280SI型手提式高壓蒸汽滅菌鍋購自上海經濟區(qū)嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；TDA-8002電熱恒溫水浴鍋購自余姚市東方電工儀器廠；SKD-2000全自動凱氏定氮儀購自上海沛歐分析儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 最佳發(fā)酵劑確定 按照玉米秸稈發(fā)酵對發(fā)酵劑的不同需求，添加纖維素酶(0.8%)、纖維素酶與酵母混合物(8︰20)進行發(fā)酵，同時以未添加發(fā)酵劑的發(fā)酵產物為對照(CK)，測定發(fā)酵飼料的粗蛋白含量，確定最佳的發(fā)酵劑種類。

1.2.2 酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈制備蛋白飼料的單因素試驗

1.2.2.1 發(fā)酵時間 在發(fā)酵溫度35 ℃、料液比1︰20、酶菌比例8︰20條件下，研究不同發(fā)酵時間(18 h、28 h、38 h、48 h、58 h、68 h)對發(fā)酵產物粗蛋白含量的影響。

1.2.2.2 酶菌比例 在發(fā)酵時間48 h、溫度35 ℃、料液比為1︰20條件下，研究不同酶菌復配比例(8︰5、8︰10、8︰15、8︰20、8︰25)對發(fā)酵產物粗蛋白含量的影響。

1.2.2.3 料液比 在發(fā)酵時間48 h、溫度35 ℃、酶菌比8︰20條件下，研究不同料液比(1︰25、1︰22、1︰20、1︰18、1︰16)對發(fā)酵產物粗蛋白含量的影響。

1.2.2.4 發(fā)酵溫度 在發(fā)酵時間48 h、料液比1︰20、酶菌比例8︰20條件下，研究不同溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃)對發(fā)酵產物粗蛋白含量的影響。

1.2.3 酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈制備蛋白飼料的正交試驗 以粗蛋白含量為考察指標，考察發(fā)酵時間、酶菌比例、料液比和發(fā)酵溫度對粗蛋白含量的影響。設計L9(34)正交試驗，因素及水平如表1。

表1 玉米秸稈發(fā)酵正交試驗因素水平

1.2.4 粗蛋白含量測定 采用微量凱氏定氮法測定樣品的含氮量[11]。粗蛋白含量=6.25×含氮量×100%。

1.3 數據處理

應用Excel軟件對單因素試驗數據進行分析，采用正交設計助手3.1版軟件對正交試驗的因素與水平進行直觀分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 玉米秸稈發(fā)酵最佳發(fā)酵劑的確定

由圖1可知，在相同的發(fā)酵條件下，未添加發(fā)酵劑(CK)時，玉米秸稈發(fā)酵后所得粗蛋白含量為5.24%，培養(yǎng)基中添加纖維素酶、纖維素酶與酵母菌混合物后，粗蛋白含量分別為20.11%和24.78%，均遠高于對照組。采用纖維素酶和酵母混合培養(yǎng)即酶菌協(xié)同發(fā)酵時，粗蛋白含量最高，其原因可能是利用纖維素酶將纖維素轉化為單糖(葡萄糖)、雙糖后，立即被酵母菌所利用，同時將培養(yǎng)物中部分無機氮轉化為菌體蛋白，達到使秸稈飼料營養(yǎng)價值提高的目的[12]。故采用酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米秸稈生產蛋白飼料。

圖1 不同發(fā)酵劑對粗蛋白含量的影響

2.2 玉米秸稈發(fā)酵單因素試驗結果

2.2.1 發(fā)酵時間 由圖2可知，發(fā)酵時間為18 h時，發(fā)酵產物粗蛋白含量最低，為14.88%，隨著發(fā)酵時間的增加，粗蛋白含量逐漸升高， 48 h以后呈降低趨勢。發(fā)酵48 h時，粗蛋白含量最高，為25.75%。因此，確定最佳發(fā)酵時間為48 h。

圖2 不同發(fā)酵時間對粗蛋白含量的影響

2.2.2 酶菌比例 由圖3可知，當酶菌的復配比例為8︰5時,粗蛋白含量最低，為12%。當酶菌復配比例為8︰20時，發(fā)酵飼料中的粗蛋白含量最高，為24.38%。其發(fā)酵產物色澤淡黃，帶有酒香，干燥后色澤變化不大。因此，最佳酶菌復配比例為8︰20。

圖3 不同酶菌復配比例對粗蛋白含量的影響

2.2.3 料液比 由圖4可知，當料液比較低時，發(fā)酵產物的粗蛋白含量呈上升趨勢，當基質中料液比為1︰20時，發(fā)酵產品中粗蛋白含量達到最高，為27.75%?？赡苁怯捎诎l(fā)酵培養(yǎng)基中顆粒疏松度合適，有利于酵母菌生長繁殖[13-14]，繼續(xù)提高培養(yǎng)基中的料液比，粗蛋白含量反而降低。因此，適宜的料液比為1︰20。

圖4 不同料液比對粗蛋白含量的影響

2.2.4 發(fā)酵溫度 由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵物粗蛋白含量呈先增加后降低的趨勢，當培養(yǎng)基溫度為35 ℃時，發(fā)酵產品中粗蛋白含量達到最高，為27.80%，這可能是因為35 ℃時菌種活度和含量較為適宜，有利于玉米秸稈飼料中纖維素分解，粗蛋白含量增加。因此,適宜的溫度為35 ℃。

圖5 不同溫度對粗蛋白含量的影響

2.3 玉米秸稈發(fā)酵正交試驗結果與分析

由表2的極差分析可知，各因素對玉米秸稈發(fā)酵產粗蛋白的影響順序由大到小為A>B>D>C，即發(fā)酵時間>酶菌比例 >發(fā)酵溫度>料液比，最佳組合方式為A2B1C2D2，即發(fā)酵時間48 h，纖維素酶和酵母菌混合比例為8︰15，料液比1︰20，培養(yǎng)溫度35 ℃。由表3方差分析的結果可知，發(fā)酵時間對發(fā)酵飼料粗蛋白含量的影響達顯著水平，而酶菌比例、料液比和發(fā)酵溫度的影響不顯著，與直觀分析結果一致。在上述最優(yōu)發(fā)酵條件下，發(fā)酵產物粗蛋白含量平均為29.71%，達到蛋白質飼料所要求的含量，與發(fā)酵前的粗蛋白含量(5.24%)相比，提高了4.67倍。且發(fā)酵產物色澤淡黃，帶有酒香，營養(yǎng)成分增加，適口性好，這樣在一定程度上有利于動物吸收，提高玉米秸稈的利用價值。

表2 玉米秸稈發(fā)酵正交試驗結果

表3 方差分析結果

注：*表示顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

本試驗對發(fā)酵玉米秸稈生產蛋白飼料的工藝進行研究。首先，對酶菌協(xié)同發(fā)酵與單獨纖維素酶發(fā)酵生產生物蛋白飼料的工藝進行了比較，結果表明，酶菌協(xié)同發(fā)酵生產的粗蛋白含量優(yōu)于單獨纖維素酶發(fā)酵。其次，確定了酶菌協(xié)同發(fā)酵蛋白飼料的最佳工藝條件：發(fā)酵時間為48 h，纖維素酶和酵母菌混合比例為8︰15，料液比為1︰20，培養(yǎng)溫度為35 ℃。在此條件下，發(fā)酵產品的粗蛋白含量由5.24%上升到29.71%，提高了4.67倍，高于國家規(guī)定的蛋白飼料中的蛋白質含量，比廖學義等[15]采用木霉與酵母混合發(fā)酵秸稈生產蛋白飼料提高了2倍左右，比張偉心等[16]采用混合菌發(fā)酵玉米秸稈生產蛋白飼料提高了1.5倍，比王慧杰等[9]采用多種混合菌發(fā)酵玉米秸稈生產蛋白飼料提高了1.1倍，改善了飼料的營養(yǎng)價值。玉米秸稈經固態(tài)發(fā)酵轉化為蛋白質飼料，既充分利用了農業(yè)廢棄物資源，又可緩解蛋白質飼料短缺的現(xiàn)狀，本研究結果為玉米秸稈生產蛋白質飼料提供了新思路。

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Production of Protein Feed from Corn Stalk by Co-fermentation of Enzyme and Microorganisms

LIU Hui1,TIAN Yahong2,LIU Ziyan1,LI Yazi2

(1.Tangshan Polytechnic College,Tangshan 063229,China; 2.College of Life Science,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

To improve the nutritional value of corn straw protein feed,the protein feed was produced by cellulase and yeast with corn stalk as raw material.Firstly,by comparing different fermentation agents,the optimum type was cellulase and yeast mixture.Secondly, by single factor and orthogonal experiments,the best process conditions of cellulase and yeast co-fermentation were determined.The effects of fermentation time, ratio of cellulase and yeast, solid-liquid ratio and temperature were investigated.The results showed the optimum conditions were as follows: fermentation time of 48 h,ratio of cellulase and yeast of 8︰15, solid-liquid ratio of 1︰20,and temperature of 35 ℃.Under the optimum conditions,the crude protein content of the fermented products reached 29.71%,which was 4.67 times higher than that before fermentation.

stalk of corn; cellulase; yeast; fermentation; protein feed

2016-06-10

華北理工大學校級大學生創(chuàng)新項目(X2014081)

劉 輝(1979-)，男，河北灤縣人，副教授，碩士，主要從事應用微生物方面的研究。E-mail：liuhuityh1979@126.com

時間：2016-11-25 14∶24∶33

S816.5

A

1004-3268(2016)12-0161-04

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20161125.1424.024.html