符策崗，曾　艷，趙紅衛(wèi)，劉　揚，肖運祥，陳海丹

(1．三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院脊柱外科/脊柱微創(chuàng)中心，脊柱醫(yī)學(xué)與創(chuàng)傷研究所，宜昌　443000；2．三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌　443000)

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技術(shù)方法

小鼠骨肉瘤模型構(gòu)建的關(guān)鍵

符策崗1，曾艷2，趙紅衛(wèi)1，劉揚1，肖運祥1，陳海丹1

(1．三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院脊柱外科/脊柱微創(chuàng)中心，脊柱醫(yī)學(xué)與創(chuàng)傷研究所，宜昌443000；2．三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌443000)

【摘要】目的探討骨肉瘤動物模型荷瘤成功率的關(guān)鍵因素。方法24只4～8周齡C3h小鼠，其中C3h/HeJ型6只、C3h/HeN型18只，隨機分為2組。A組采用一般脫毛膏脫毛后外側(cè)腋下注射濃度為5×107個數(shù)量級/mL的LM8細胞懸液0.2 mL；B組采用動物剃毛器剃毛后外側(cè)腋下皮下注射濃度為5×107個數(shù)量級/mL的LM8細胞懸液0.2 mL后每日給于注射處局部按摩，并分別記錄腫瘤生長情況。結(jié)果A組成瘤率33%(4/12)；B組成瘤率100%。結(jié)論不同的注射技巧對LM8的荷瘤過程及后期護理對成瘤率具有重要的意義。

【關(guān)鍵詞】】 C3h；骨肉瘤；模型

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)好發(fā)于兒童和青少年，而在25～59歲之間發(fā)病率相對較低，這可能說明骨肉瘤發(fā)病與骨的生長活動有關(guān)[1]。骨肉瘤的好發(fā)部位是肱骨遠端、股骨遠端和脛骨近端，臨床治療主要以手術(shù)聯(lián)合化療為主，雖然在很大程度上提高了患者的生存率，但由于化療耐藥性和腫瘤轉(zhuǎn)移使得部分患者的死亡率居高不下。因此，借助各種腫瘤動物模型研究骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展、開發(fā)新型藥物和治療方式對提高OS患者的生存率具有重要意義。腫瘤細胞移植是常用的建模方法之一，但在實際工作中發(fā)現(xiàn)，不同的前/后期處理對荷瘤的成功率及腫瘤的生長具有很大影響，尤其是在非裸鼠荷瘤的過程中。近幾年，腫瘤免疫逃逸及腫瘤免疫有關(guān)的研究廣受人們關(guān)注，且探討腫瘤免疫相關(guān)基因、蛋白及蛋白糖基化修飾對腫瘤的影響已經(jīng)成為研究熱點之一[2]。因此，一個穩(wěn)定的、成瘤率高且免疫力健全的動物模型成為了免疫機制相關(guān)體內(nèi)試驗的關(guān)鍵。在此，我們將對比C3h小鼠荷瘤過程中的細節(jié)問題并進行探討。

1材料和方法

1.1實驗動物

SPF級C3h小鼠，周齡在4～8周，體重在20～30g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供【SCXK(鄂)2014-0004】【SYXK(鄂)2011-0061】，C3h/HeJ型6只和C3h/HeN型18只，雌雄兼?zhèn)?。其實驗操作和飼養(yǎng)均在SPF 條件下的超凈層流架中進行，滅菌處理的水和飼料供動物自由攝入。實驗分為A，B兩組，A組采用脫毛膏備皮后右外側(cè)腋下注射濃度5×107個數(shù)量級/mL的LM8細胞懸液0.2 mL；B組采用動物剃毛器備皮后右外側(cè)腋下皮下注射濃度5×107個數(shù)量級/mL的LM8細胞懸液0.2 mL后每日給于注射處局部按摩，每組各12只。

1.2主要試劑

αMEM培養(yǎng)基：由Thermo公司提供；胎牛血清(FBS)：由四季青公司提供(使用前56 ℃水浴30 min滅活)；胰酶及其他實驗試劑：由宜昌市中心人民醫(yī)院中心實驗室提供；芊茗草脫毛膏和電動剃毛器由網(wǎng)上購買。

1.3細胞

C3h小鼠源性LM8骨肉瘤細胞購自第四軍醫(yī)大學(xué)西京骨科醫(yī)院實驗室，用含10 %胎牛血清αMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，用0.25 %胰酶消化傳代，每2～3 d傳代1 次。

1.4C3h小鼠骨肉瘤模型的建立

1.4.1小鼠前期處理

A組：荷瘤前兩小時將脫毛膏抹于小鼠右外側(cè)腋下，范圍為已擬定荷瘤部位為圓心半徑為2 cm區(qū)域，待局部鼠毛脫落后無菌生理鹽水水洗凈，可清晰觀察到皮膚組織和皮下血管。B組：荷瘤前兩小時使用電子剃毛器剔除小鼠右外側(cè)腋下局部鼠毛，范圍同上。

1.4.2細胞前期處理

荷瘤前24 h，需給細胞常規(guī)更換培養(yǎng)基，保持細胞密度占培養(yǎng)瓶的50%左右。荷瘤前觀察細胞密度，挑取細胞密度在80%～90%活力較好的細胞用于荷瘤。

1.4.3小鼠荷瘤

0.25 %胰酶消化細胞后，收集于無血清αMEM培養(yǎng)基中，定容至5×107個數(shù)量級/mL后取0.2 mL皮下注射于小鼠右腋中線下1 cm處。

1.5荷瘤后期處理與觀察腫瘤

移植完成后，A組：逐日觀察移植部有無感染，腫瘤生長后有無自然消退，有無破潰出皮膚。B組：在A組觀察項目的基礎(chǔ)上給予荷瘤處局部按摩(以荷瘤部位為按摩點做按壓滑動按摩)10 s。

2結(jié)果

A組：荷瘤時可觀察到明顯局部皮丘，荷瘤后1 d可見皮丘明顯縮??；荷瘤后5 d 66%(8/12)小鼠荷瘤部位皮膚平坦，33%(4/12)局部凸起；荷瘤后10 d，66%(8/12)仍保持局部平坦，33%(4/12)凸起持續(xù)增大，但未見破潰出皮膚；荷瘤后20 d，66%(8/12)小鼠荷瘤部位皮膚平坦，未見其他不適癥狀，33%(4/12)可見腫瘤生長處局部皮膚出現(xiàn)破潰。B組：荷瘤時可觀察到明顯局部皮丘，荷瘤后1 d可見皮丘明顯縮??；荷瘤后5 d 100%(12/12)小鼠荷瘤部位凸起明顯，按壓刺激腫瘤時有可能加速皮膚破潰；荷瘤后10 d，凸起持續(xù)增大并出現(xiàn)破潰；荷瘤后20 d，可見腫瘤生長處局部皮膚出現(xiàn)破潰。

3討論

骨肉瘤動物模型的建立包括自發(fā)、誘導(dǎo)、腫瘤移植和基因工程等方式，常用的實驗動物有犬、鼠和斑馬魚等[3-4]。理想的動物模型對研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，以及新型藥物和治療方式的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)作用。雖然自發(fā)型OS模型未加入其他人為因素的影響是最理想的模型，但多數(shù)自發(fā)腫瘤模型多見于成年犬類，且發(fā)病迅速不利集體實驗。誘發(fā)型OS模型相對容易獲取并穩(wěn)定，目前也作為主要的OS模型獲取方式之一，并適用于多種實驗研究。但由于人為誘導(dǎo)方式一定程度的也影響了對OS發(fā)病機制和病理特點的研究。轉(zhuǎn)基因模型建立技術(shù)雖然能更好地模擬人體內(nèi)生理、病理環(huán)境，與所研究腫瘤的發(fā)生過程具有較好的一致性，但是誘導(dǎo)出來的骨肉瘤僅有16.3%發(fā)生于四肢骨，并不能很好的用于實驗[5]。

腫瘤移植是近年常用的腫瘤模型構(gòu)建方式之一，由于其的操作簡單、動物成瘤穩(wěn)定且均一性好而廣受科研工作者的青睞[6]。根據(jù)腫瘤的來源不同可將腫瘤移植分為異種移植和同種移植。異種移植是指腫瘤來源和動物模型并不是同一個物種，因此存在免疫排斥，所以常用裸鼠作為實驗?zāi)Ｐ?，常用于與免疫系統(tǒng)無關(guān)的實驗。相對于異種移植，同種移植常被用于免疫相關(guān)的實驗研究中。常用的模型有UMR-106荷瘤的Sprague-Dawley[7]和LM8荷瘤的C3h小鼠[8]。兩篇報道均稱局部注射UMR-106或LM8均可100%的建立腫瘤模型，但我們在日常操作時由于細節(jié)的忽視可能達不到這樣的成瘤率。因此，我們嘗試對比不同的荷瘤操作及后期護理對荷瘤率的影響，已確保荷瘤的成功率，為后期實驗提供有價值的指導(dǎo)。

本實驗以C3h鼠源性LM8細胞以5×107個數(shù)量級/mL的細胞懸液0.2 mL皮下注射于小鼠右腋中線下1 cm處，并觀察不同前/后期小鼠處理對小鼠荷瘤率及腫瘤生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用剃毛器備皮，并在荷瘤后每日給予相應(yīng)按摩刺激，能顯著提高成瘤率且腫瘤生長迅速。備皮方式和局部按摩能幫助刺激腫瘤生長提高荷瘤率。

本實驗同時發(fā)現(xiàn)許多有價值的操作方式方法。1)保證細胞活力：荷瘤前一天常規(guī)給細胞更換培養(yǎng)基，并保持細胞密度在50%左右，待次日荷瘤時密度在80%～90%，細胞活力較強，荷瘤成功率較高。2)C3h/HeN型小鼠腫瘤模型穩(wěn)定性高：C3h小鼠HeJ型(C3H/HeJ-Pde6brd1，在脂多糖反應(yīng)位點的突變(Tlr4Lps-d)使得它對內(nèi)毒素耐受，對革蘭氏陰性菌高度易感。攜帶rd(視網(wǎng)膜退化)基因，在離乳周齡時便會產(chǎn)生失明。)與HeN型(除沒有Tlr4位點突變外其余特征和C3h/HeJ基本類似，對內(nèi)毒素敏感。)對比發(fā)現(xiàn)，HeN型整個實驗過程中并不存在自然死亡，而HeJ型在未形成皮下腫瘤的小鼠，在第30天發(fā)現(xiàn)存在自然死亡1例，34 d發(fā)現(xiàn)2例(解剖后均未發(fā)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤)。3)皮下注射：腫瘤細胞皮下注射深度及進針長度對腫瘤的成長具有重要影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，皮下注射較淺會引起注射后局部皮膚隆起明顯并透亮的實驗鼠常在第5天即可發(fā)現(xiàn)腫瘤破潰皮膚而流出，以及入針部位距離注射部位較近會引起退針時細胞液流出較多并影響后期腫瘤大小的測量。通過改良注射的方式后發(fā)現(xiàn)，將注射器針頭深入皮下，并沿著皮下皮膚游行10～15 mm后針尖抵住肋骨注射腫瘤細胞，能有效保證足夠的皮下空間給予腫瘤生長，并退減少時腫瘤細胞流出皮膚。4)小鼠抓持手法：注射腫瘤細胞時，抓住小鼠頸背部并輕壓于籠子上方注射腫瘤細胞相對于抓起小鼠頸背部、右后肢及尾巴并翻轉(zhuǎn)注射要易于操作，且小鼠更容易配合。5)荷瘤速度及重懸：當細胞從重懸計數(shù)到注射時間不宜超過30 min，且使用無血清的αMEM作為重懸液相對PBS更為穩(wěn)定。

致謝：感謝湖北宜昌中心人民醫(yī)院中心實驗室對本課題的大力支持。

參考文獻：

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[2]Chen H D, Zhou X, Yu G,etal. Knockdown of core 1 beta 1, 3-galactosyltransferase prolongs skin allograft survival with induction of galectin-1 secretion and suppression of CD8+ T cells: T synthase knockdown effects on galectin-1 and CD8+ T cells.[J]. Journal of Clinical Immunology, 2012, 32(4):820-836.

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[8]潘海濤, 楊述華, 劉勇, 等. 可移植性鼠骨肉瘤腫瘤模型的建立[J]. 華中醫(yī)學(xué)雜志, 2005,29(6):471-472.

〔修回日期〕2015-11-23

[基金項目]國家自然科學(xué)基金(81302346)；宜昌市科技研究基金(A12301-06)；宜昌市中心人民醫(yī)院基金(KFJ2011009)。

[作者簡介]符策崗(1991-)，男，碩士生，專業(yè)：骨外科。Email：fucegang005@sina.com。 [通訊作者]陳海丹(1982-)，男，博士，研究方向：免疫學(xué)。Email：wenquanchd@sina.com。

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0073-03

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.014

Keys in constructing osteosarcoma model of mouse

FU Ce-gang1, ZEN Yan2, ZHAO Hong-wei1, LIU Yang1, XIAO Yun-xiang1, CHEN Hai-dan1

(1．Institute of Spinal Medicine and Trauma, Department of Spinal surgery Ward/Center for Minimally Invasive Spine Surgery,The First College of Clinical Medical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443000, China. 2．Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443000, China)

【Abstract】ObjectiveInvestigating the key factors in constructing animal model of osteosarcoma. Methods24 C3h mice (C3h/HeJ type 6, C3h/HeN type 18 at 4-8 weeks old) were randomly divided into 2 groups: A group: Subcutaneous inject 0.2 mL of 5×107cells/ml mL LM8 suspension in lateral armpit before treated with depilatory creams; B group: subcutaneous inject 0.2 mL of 5×107cells/mL LM8 suspension in lateral armpit before treated with shaver, and the tumor growth was recorded. ResultsThe rate of A was 30% (4/12), and the rate of B was 100%. Conclusions Injected techniques and the way of post handle play important role in constructing osteosarcoma model.

【Key words】C3h; Osteosarcoma; Models