尹柏雙　王秋竹++付連軍等

摘要：為研究奶牛隱性乳房炎發(fā)病程度與乳清中結(jié)合珠蛋白（HP）含量變化的關(guān)系，選取6頭健康奶牛和18頭患輕、中、重度隱性乳房炎奶牛為試驗(yàn)動(dòng)物，采集乳樣、分離乳清，利用HP ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品中HP含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著隱性乳房炎病情加重、乳汁體細(xì)胞數(shù)的增加，乳清中HP含量逐漸升高，與健康對(duì)照組比較升高極顯著（P<0.01）。結(jié)果表明，乳清中HP含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關(guān)性，乳腺損傷程度和乳汁體細(xì)胞數(shù)與乳清中HP含量呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：隱性乳房炎；奶牛；乳清；結(jié)合珠蛋白

中圖分類號(hào)： S858.232+.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0289-02

收稿日期：2014-11-10

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：20130206040NY）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（編號(hào)：吉教科合字2013339）；吉林市科技局杰出青年培育專項(xiàng)（編號(hào)：2013625019）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科培育項(xiàng)目（編號(hào)：吉農(nóng)科合字2013X021）。

作者簡介：尹柏雙（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授，從事奶牛乳腺疾病方向的研究工作。E-mail：ybs3421@126.com。奶牛乳房炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，其中隱性乳房炎發(fā)生率最高。隱性乳房炎可引起泌乳奶牛產(chǎn)奶量下降、牛奶品質(zhì)降低、養(yǎng)殖成本增加、產(chǎn)后發(fā)情延長、妊娠時(shí)間推遲，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。結(jié)合珠蛋白（HP）是血清α2球蛋白組中的一種酸性糖蛋白，在哺乳動(dòng)物血液和其他體液中廣泛分布，具有結(jié)合炎癥疾病標(biāo)記物、游離血紅蛋白、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等主要功能[2-6]。Grnlund等研究表明，在金黃色葡萄球菌引起奶牛乳房炎的急性期，血清結(jié)合珠蛋白的表達(dá)量增加[7]。楊永新等研究表明，臨床型乳房炎奶牛乳汁中結(jié)合珠蛋白表達(dá)量顯著增加[8]。本試驗(yàn)研究乳清中結(jié)合珠蛋白表達(dá)量與不同程度奶牛隱性乳房炎發(fā)病的關(guān)系，以期為隱性乳房炎判定提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

通過乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)后選擇年齡、胎次、產(chǎn)奶量、泌乳期等指標(biāo)相近的健康奶牛6頭和患不同程度奶牛隱性乳房炎奶牛18頭，由吉林市某奶牛場提供。

1.2主要試劑與儀器

結(jié)合珠蛋白（HP）含量測(cè)定用HP ELISA試劑盒，購于南京建成生物試劑研究所；主要儀器有Fossmatic 5000體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（FOSS公司，丹麥）、Varioskan酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國）、離心機(jī)（Sigma公司，美國）。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物分組

通過乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)后將試驗(yàn)?zāi)膛７殖山】祵?duì)照組[6頭，體細(xì)胞數(shù)量（SCC）<10×104 個(gè)/mL]、輕度隱性乳房炎組（6頭，50×104 個(gè)/mL500×104 個(gè)/mL）。

1.4乳樣采集

采集試驗(yàn)?zāi)膛５娜橹?，采樣前?duì)乳區(qū)進(jìn)行清洗，然后用70%乙醇消毒乳區(qū)，棄掉前3 把乳汁，分別采10 mL乳裝入無菌試管中，將采集的乳樣放到冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.5乳清制備

將采集的乳樣于3 000 r/min離心5 min，除去上層乳脂，然后于16 000 r/min高速離心機(jī)中離心10 min，去除沉淀，保留上清，4 ℃條件下保存、待測(cè)。

1.6檢測(cè)方法

乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)采用體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定；HP含量采用HP ELISA試劑盒測(cè)定，在酶標(biāo)儀上比色測(cè)定D450 nm吸光值，根據(jù)試劑盒說明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算HP含量。

1.7數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)作單因素方差分析，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1乳清中結(jié)合珠蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

通過ELISA HP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)5個(gè)濃度梯度的HP標(biāo)樣的 D450 nm，利用ELISA Calc回歸/擬合軟件進(jìn)行分析。以HP濃度為自變量X（μg/mL）、D450 nm為因變量Y，擬合直線回歸方程為：y=0.069 54x+0.144 46，r2=0.998 51，濃度與吸光度線性回歸良好，表明該方法檢測(cè)樣品值可信度較高（圖1）。

2.2乳清中結(jié)合珠蛋白檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，患輕度乳房炎奶牛乳清中HP含量為74111 μg/mL，極顯著高于健康對(duì)照組；同樣，患中、重度乳房炎奶牛乳清中HP含量也極顯著高于健康對(duì)照組。此外，隨著乳房炎病情加重、乳汁體細(xì)胞數(shù)增加，乳清中HP含量逐漸升高，表明乳腺損傷程度和乳汁體細(xì)胞數(shù)與乳清中HP含量呈正相關(guān)。

表1奶牛乳清中C-反應(yīng)蛋白含量

組別樣品數(shù)量（個(gè)）HP含量（μg/mL）健康對(duì)照組632.573±4.947輕度乳房炎組674.111±10.357**中度乳房炎組677.093±4.394**重度乳房炎組686.146±8.521**注：“**”表示與對(duì)照組比較差異極顯著（P<0.01）。

3討論

結(jié)合珠蛋白主要由肝臟合成，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，屬急性期反應(yīng)蛋白，其表達(dá)受細(xì)胞因子和前列腺素（PG）等不同因素的調(diào)節(jié)，炎癥、創(chuàng)傷和感染等病理狀態(tài)也會(huì)影響血液HP含量的變化[9]。Khoshvaghpi等研究患有外科感染、急性子宮炎奶牛血清和牛奶中HP變化結(jié)果表明，血清和牛奶中HP濃度均高于健康奶牛[10]。楊永新等研究結(jié)果表明，大腸桿菌性乳房炎奶牛血漿中結(jié)合珠蛋白表達(dá)量顯著高于健康奶牛[11]；試驗(yàn)誘導(dǎo)或自然發(fā)生的大腸桿菌乳房炎奶牛血清中結(jié)合珠蛋白的濃度增加[12-13]；患輕度乳房炎奶牛血清和牛奶中HP含量均升高[14]；陳國燦等檢測(cè)自然感染隱性乳房炎奶牛乳汁中的結(jié)合珠蛋白濃度結(jié)果表明，奶?；茧[性乳房炎時(shí)，其肝臟合成的HP增加，導(dǎo)致乳汁中HP含量也增加[15]；Grnlund等報(bào)道，患金黃色葡萄球菌性乳房炎的奶牛，在急性期時(shí)乳汁和血清中HP含量迅速升高[7，16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與健康對(duì)照組相比，患隱性乳房炎奶牛乳清中HP含量極顯著升高，隨著隱性乳房炎病情加劇，乳汁中HP含量逐漸升高，這與以往研究結(jié)果基本一致。在臨床獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域針對(duì)我國奶牛隱性乳房癌高發(fā)病率和診斷技術(shù)相對(duì)落后的情況下，利用乳清中HP含量變化的特點(diǎn)，開展早期快速診斷將具有廣闊的研究空間和發(fā)展前景。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，乳清中HP含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關(guān)性，隨著乳腺損傷程度和乳汁體細(xì)胞數(shù)增加，乳清中HP含量顯著升高。

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