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電感耦合等離子體質譜檢測人全血中的汞

金屬汞及其化合物主要以蒸汽或粉塵形態(tài)經(jīng)呼吸道進入人體；因可溶于類脂質，如與皮膚直接接觸時也可經(jīng)完整皮膚進入體內。汞中毒表現(xiàn)有神經(jīng)精神癥狀、口腔炎癥表現(xiàn)、汞毒性皮炎、心功能損傷、腎功能損傷等臨床表現(xiàn)[1]。目前生物樣本中汞的測定方法主要包括原子吸收光譜法(atomic absorption spectroscopy，AAS)、原子熒光光譜法(atomic fluorescence spectroscopy，AFS)、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES)和電感耦合等離子體質譜法(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)。其中AAS檢測汞元素操作方便，成本低，穩(wěn)定性好，是目前臨床上常用的檢測方法。但是該方法單批次只能檢測單一樣本形式(液體類、固體類)中的單一的汞元素，而且單個樣本檢測時間長，不能批量上機檢測，從而不能有效節(jié)約檢測時間。ICP-MS檢測具備靈敏度高、線性范圍廣和多元素同時檢測的特點。我們采用鹽酸作為基體，研究ICP-MS檢測人全血汞元素的可行性。

材料和方法

一、相關工作液的配制

1.試劑來源鹽酸[分析純(analytical reagent，AR)]購自江蘇強盛功能化學股份有限公司；硝酸(AR)、雙氧水(AR)購自德國默克公司；超純水(18.2 MΩ)用美國密理博(Millipore)超純水儀制備；調諧液(鋰、釔、鈰、鉈、鈷，10 ng/mL，批號3-733BD)購自安捷倫公司；ICP-MS汞標準溶液(1 mg/mL，批號212075014)、ICP-MS錸標準溶液(1 mg/mL，批號211095099)購自美國AccuStandard公司；全血汞質控品購自美國Kaulson Laboratories公司(批號HMB293R11&HMB894R0)。

2.調諧液10 ng/mL調諧液用2%硝酸配制成1 ng/mL調諧工作溶液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.內標液1 mg/mL 錸標準溶液用2%硝酸配制成1 μg/mL內標工作溶液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.汞標準液1 mg/mL汞標準溶液用2%鹽酸配制成0.1、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 ng/mL標準液，置聚酯瓶中，4 ℃?zhèn)溆?。標準溶液最多使?周，及時更換。標準曲線每天繪制。

二、儀器主要參數(shù)設置

AGILENT 7500CE型ICP-MS儀(美國安捷倫科技有限公司)。主要工作參數(shù)設置：射頻功率(radio-frequency power，RF)為1 500 W；采樣深度為8.5 mm；載氣流為0.7 L/min；補償氣體流量為0.2 L/min；蠕動泵轉速為0.1 r/s；霧化器溫度為2 ℃。MARS5型微波消解儀(美國CEM公司)主要工作參數(shù)見表1。

表1　微波消解儀工作參數(shù)

注：功率1 600 W(100%)表示儀器的最大使用功率和精密度的調節(jié)，即儀器的最大使用功率為1 600 W時的最小調節(jié)單位為16 W

三、全血消解(全血前處理)

消解罐放入50%硝酸浸泡過夜，取出消解罐，用去離子水清洗3次，倒扣，放入烘箱中烘干。取100 μL去離子水，混合均勻的全血汞質控品及待測全血分別置于烘干的消解罐中，每個消解罐分別繼續(xù)加入200 μL硝酸、200 μL雙氧水和20 μL鹽酸。蓋上消解蓋，按次序放入消解盤中按微波消解儀設置好的程序進行消解。消解完成后待消解罐冷卻，加入2%鹽酸溶液2 mL稀釋待測。

四、定標過程

儀器使用前用調諧液優(yōu)化儀器工作參數(shù)，使儀器的氧化物干擾<1.5%，雙電荷干擾<3%。標準液按以下次序進樣：空白(2%鹽酸)、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ng/mL。同時內標液通過三通閥與進樣管混勻進入儀器檢測。

取2 mL稀釋待測樣本溶液置于樣本杯中，在優(yōu)化儀器狀態(tài)下檢測樣本。每9個樣本加1個2%鹽酸空白，沖洗管道。

五、方法學評價

2.功能靈敏度的確定在預期檢測限附近5份不同濃度的標準液重復性試驗測定結果中，變異系數(shù)(coefficient of variation，CV) 為 20%時的最低檢測濃度為功能靈敏度[2]。不同濃度的溶液前處理過程同全血前處理過程一樣，上機檢測即可。

3.分析測量范圍試驗收集全血檢測后血汞含量很低的全血(新生兒或幼兒全血)，混合均勻?；旌虾煤蟮娜骄殖?份，1份作為低值(L)樣本，另1份加入汞標準溶液，混合均勻后作為高值(H)樣本。按1L、0.95L+0.05H、0.90L+0.10H、0.80L+0.20H、0.60L+0.40H、0.40L+0.60H、0.20L+0.80H、1H的配制方法，制成8個不同濃度的系列評價樣本。樣本的前處理過程同全血消解過程一樣，上機檢測，每個樣本檢測4次，每檢測1次需要加入1個空白。因為汞有吸附作用所以按由低濃度到高濃度檢測，1 d內完成。

4.回收率試驗取隨機混合均勻全血1份，從中吸取相同4份100 μL全血于消解罐中。每個消解罐依次加入200 μL硝酸、200 μL雙氧水、20 μL鹽酸。然后第1份加入20 μL去離子水作為基礎樣本；第2份加入100 ng/mL標準溶液20 μL作為樣本1；第3份加入250 ng/mL標準溶液20 μL作為樣本2；第4份加入500 ng/mL標準溶液20 μL作為樣本3。蓋上消解蓋，依程序進行消解。消解完畢后待冷卻，加入2%鹽酸溶液2 mL，上機檢測。

5.精密度試驗將2個水平全血質控品每天和樣本同批次消解上樣，共20 d。質控品檢測結果可以作為準確度，20 d(次)質控結果相對標準差作為批間精密度。臨床隨機混合全血、2個水平全血質控品同全血前處理一樣分別消解20份，1 d內連續(xù)檢測完成，全血結果及2個水平全血質控的相對標準差作為批內精密度。

六、血汞參考區(qū)間及測定樣本

目前，國內外文獻都參考美國環(huán)保局(U.S. Environmental Protection Agency，USEPA)制定的0~5.8 μg/L作為血汞的參考區(qū)間。2001年， USEPA頒布了新的水體甲基汞環(huán)境質量標準，這一標準中設定的參考劑量比原來的推薦劑量低30～70倍，相應的血汞參考濃度為5.8 ng/mL[3]，比原來的參考濃度(200～500 ng/mL)低34~86倍。0～5.8 ng/mL是目前公認的血汞安全范圍。USEPA在另外1篇關于美國育齡期婦女血汞濃度和魚類消費趨勢的研究中也以5.8 ng/mL作為血汞參考值[4]，以此統(tǒng)計不同年齡段血汞的超標率(>5.8 ng/mL)。松原市產(chǎn)婦和新生兒血汞濃度及健康風險研究中也以5.8 μg/L作為血汞的參考標準[5]。因此，本實驗室的血汞參考區(qū)間為0～5.8 μg/L。

本研究用于血汞測定的36份全血樣本從全國0～6歲的健康體檢兒童全血樣本中隨機抽取。

結果

一、線性方程和檢出限

儀器對汞標準溶液自動讀值3次，計算平均值，標準曲線各濃度信號數(shù)值見圖1。標準曲線方程為Y=6.967×10-2X-3.859×10-4，r=0.999 9，線性相關良好。

相同條件消解11份空白樣本，檢測汞濃度，得出空白均值及標準差，計算得LLD為3.862×10-2ng/mL，BLD為4.525×10-2ng/mL，滿足臨床檢測要求。

取5份不同濃度的標準溶液，每份進行20次重復檢測。1 ng/mL標準品重復檢測的CV為18.45%，最接近20%，此時檢測限樣本濃度為1.495 ng/mL。因此，ICP-MS檢測全血汞的功能靈敏度為1.495 ng/mL，滿足臨床檢測要求。見表2。

圖1　汞標準曲線

項目汞標準液濃度(ng/mL)00.51.02.05.0x0.03071.01501.49502.25705.2270s0.00870.12460.27580.16280.2868CV(%)28.4412.7618.457.2135.487

二、分析測量范圍

8個不同濃度系列樣本檢測4次，計算均值，計算斜率時要減去低濃度空白。平均斜率乘以加入汞的相對量即為預期值。見表3。

以預期值為X、測量均值為Y作散點圖，目測呈一條直線，見圖2。方程為Y=1.03X+0.07，r2=0.999 8，說明預期值與測量值之間相關性良好；斜率為1.03，符合斜率在0.97～1.03之間的要求；截距為0.07，與“0”之間無差異。該方法在0.18～13.83 ng/mL范圍內呈線性。

三、回收率

低、中、高濃度的回收率為92%～103%。見表4。

表3　分析測量范圍檢測結果

注：Y=1.03X+0.07，r2=0.999 8

圖2　汞的預期值和測量值的散點圖

四、準確度及精密度測定

對2個水平的全血質控品進行20 d檢測，高值[(50±8) ng/mL]和低值[(20±5) ng/mL]質控品的測定均值分別為51.39和22.22 ng/mL，相對標準差(穩(wěn)定性)分別為5%和6%；全血質控品的準確度及批間精密度均在要求范圍內。1 d內完成檢測臨床隨機混合全血及2個水平的全血質控品各20份，混合全血測定均值為2.051 ng/mL，相對標準差為(穩(wěn)定性)4.8%。高、低值質控品的測定均值分別為50.60、21.60 ng/mL，相對標準差(穩(wěn)定性)分別為4.4%、4.8%，全血質控品的準確度及批內精密度均在要求范圍內。

五、人全血樣本測定

36份血樣的全血汞濃度范圍為1.931～4.541 ng/mL，均值為2.690 ng/mL，相對標準差為20%，全血汞濃度均在參考區(qū)間內，無異常數(shù)據(jù)或汞中毒情況。

討論

汞具有較強的記憶效應，易吸附于管道，導致之后的檢測結果偏高，影響檢測結果。ALLIBONE等[6]在待測溶液中加入金溶液，形成金汞齊，使汞不容易吸附于管道，這樣既不影響離子化效率，對檢測的靈敏度也不產(chǎn)生影響。有研究表明，加入的金溶液濃度與樣本濃度的比例為20∶1～1∶1，可以較好地解決汞的吸附效應[7-8]。但是正常人全血汞濃度較低，又經(jīng)過稀釋，故不需要加入金溶液來降低記憶效應[9-10]。雖然正常全血的汞濃度量很低，但是隨著儀器檢測樣本的增多，汞的記憶效應還是不可忽視的。試驗過程中需注意監(jiān)測異常血汞濃度和長期檢測汞的累積效應。為了提高檢測結果的準確性和消除汞的記憶效應，長期檢測汞元素時可以通過以下幾種方式解決這個問題：(1)加入相當濃度(20∶1～1∶1)的金溶液；(2)試驗樣本中增加空白樣本用來清洗管道；(3)定期清洗儀器內部管道。這些措施可以降低汞對管道的吸附效應。

本研究結果顯示，使用ICP-MS檢測全血汞的生物檢出限為4.525×10-2ng/mL，功能靈敏度為1.495 ng/mL，分析測量范圍為0.18～13.83 ng/mL，在此范圍內線性良好(r2=0.999 8)，回收率為92%～103%，說明在低、中、高3個生物學濃度范圍該儀器檢測準確度符合要求。低值和高值質控品的20 d測定均值均在質控品定值范圍內，相對標準差(穩(wěn)定性)分別為6%、5%，質控結果準確并且批間精密度<10%。1 d內檢測臨床隨機混合全血相對標準差(穩(wěn)定性)為4.8%，低值和高值質控品的測定均值均在質控品定值范圍內，相對標準差(穩(wěn)定性)分別為4.8%、4.4%，質控結果準確并且批內精密度<5%。由此可見，ICP-MS檢測全血汞穩(wěn)定、可靠，短期檢測不加金溶液也能符合檢測要求，可以滿足臨床的檢測需要。

臨床上對于一些未知原因的重金屬中毒可以采用ICP-MS一起篩查，大大節(jié)約了排查時間和檢測時間；因ICP-MS儀器可以批量上樣，樣本量較大時(職業(yè)病篩查、科研研究等)也可快速檢測；臨床上的其他體液，如尿液等的檢測更加方便(不需要進行前處理)，僅需根據(jù)濃度調整稀釋倍數(shù)或直接上樣檢測，這為治療時監(jiān)測尿液汞濃度和用藥效果提供了依據(jù)；也為臨床和流行病學研究職業(yè)或非職業(yè)重金屬暴露人群的重金屬水平以及診斷臨床上的相關疾病提供了依據(jù)。

與其他方法相比，ICP-MS的優(yōu)點是可以同時檢測多種元素(包括其他重金屬和必需微量元素)[11-12]，大大縮短了檢測時間，節(jié)約了人力和物力成本，可以監(jiān)測中毒元素治療療效，發(fā)現(xiàn)治療過程中必需微量元素的流失，為臨床醫(yī)生診療提供比較全面的元素動態(tài)分析。

參考文獻

[1]倪亞明，顏崇淮，張敬，等. 微量元素與營養(yǎng)健康[M].上海：同濟大學出版社，2009：136-142.

[2]李萍. 臨床實驗室管理學[M]. 北京：高等教育出版社，2006：20-44.

[3]BORUM DR，MANIBUSAN MK，SCHOENY RS，et a1. Water quality criterion for the protection of human health：methylmerucry. In 6th International Conference on Mercury as a global pollutant[C]. Minamata Japan：Environmental Protection Agency, 2001.

[4]U.S.Environmental protection agency. Trends in blood mercury concentrations and fish consumption among U.S. women of childbearing age[S]. EPA-823-R-13-002， EPA, 2013.

[5]張磊，王起超.松原市產(chǎn)婦和新生兒血汞濃度及健康風險研究[J]. 生態(tài)環(huán)境，2008，17(3)：989-992.

[6]ALLIBONE J，F(xiàn)ATEMIAN E，WALKER PJ．Determination of mercury in potable water by ICP-MS using gold as a stabilising agent[J]．J Anal Atom Spectrom，1999，14(2)：235-239．

[7]馬棟，張丹，卓先義，等. 微波消解ICP-MS法檢測生物檢材中汞元素[J]. 法醫(yī)學雜志，2011，27(3)：193-195.

[8]張丹，馬棟，卓先義. 微波消解ICP-MS法測定人發(fā)中的汞[J]. 中國司法鑒定，2011，12(6)：23-25.

[9]馬道明，杜耀偉，岳曼，等. ICP-MS測定飲用水中汞[J].廣州化工，2012，40(13)：121-123.

[10]劉麗萍，張妮娜，張嵐，等. 電感耦合等離子體質譜法測定礦泉水中23種元素[J].質譜學報，2005，26(1)：27-31.

[11]余曉剛，顏崇淮，沈曉明，等. 電感耦合等離子體質譜檢測人體血鉍濃度方法的建立[J].檢驗醫(yī)學，2006,21(6)：681-683.

[12]余曉剛，焦先婷，劉曉青，等. 肝豆狀核變性患者青霉胺治療期間晨尿金屬元素譜分析[J].檢驗醫(yī)學，2010,25(8):644-646.

(本文編輯：龔曉霖)

劉軍霞，周昕，顏崇淮

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院環(huán)境試驗室，上海 200092)

摘要：目的研究電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)檢測全血中汞的可行性。方法采用鹽酸作為樣本基質，用微波消解儀對全血進行消解，然后用ICP-MS檢測全血汞，驗證ICP-MS的檢測下限、功能靈敏度、分析測量范圍、回收率、準確度和精密度。結果ICP-MS的檢出限為4.525×10-2ng/mL，功能靈敏度為1.495 ng/mL，分析測量范圍為0.18～13.83 ng/mL，回收率為92%～103%。低值[(20±5)ng/mL]和高值[(50±8)ng/mL]質控品20 d檢測均值分別為22.22和51.39 ng/mL，批間精密度分別為6%和5%；1 d內檢測臨床隨機混合全血、低值和高值全血質控品各20份，批內精密度分別為4.8%、4.8%、4.4%。結論ICP-MS檢測全血汞可以滿足臨床要求。

關鍵詞：電感耦合等離子體質譜；汞；全血

Determination of mercury in whole blood by inductively coupled plasma-mass spectrometryLIUJunxia，ZHOUXin，YANChonghuai. (DepartmentofEnvironmentalHealth，XinhuaHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200092，China)

Abstract:ObjectiveTo study the feasibility of inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) for whole blood mercury determination. MethodsUsing hydrochloric acid as sample matrix， samples were digested with microwave digestion instrument, and ICP-MS was used to determine mercury in whole blood. The lowest detection limit,functional sensitivity, range, recovery, accuracy and precision of ICP-MS were evaluated. ResultsThe detection limit of this method was 4.525×10-2ng/mL， the functional sensitivity was 1.495 ng/mL， the analytical measurement range was 0.18-13.83 ng/mL， and the recovery rate was 92%-103%. The average values of low-level [(20±5) ng/mL]and high-level [(50± 8)ng/mL] quality control materials for 20 d were 22.22 ng/mL and 51.39 ng/mL， and between-run precisions were 6% and 5%. Clinical random mixed whole blood, low and high whole blood quality control materials for 20 parts each were detected within 1 d， and the within-run precisions were 4.8%， 4.8% and 4.4%. ConclusionsICP-MS for the determination of whole blood mercury meets the clinical requirements.

Key words:Inductively coupled plasma-mass spectrometry；Mercury； Whole blood

收稿日期：(2015-02-25)

通訊作者：顏崇淮，聯(lián)系電話：021-25078857。

作者簡介：劉軍霞，女，1986年生，學士，技師，主要從事質譜元素分析工作。

基金項目：環(huán)境保護部環(huán)保公益性項目(201309048)；科技部973課題(2012CB525001)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)12-1229-05R446.1

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.016