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化學(xué)發(fā)光微粒法檢測(cè)抗TP抗體復(fù)檢流程探討

梅毒螺旋體(treponema pallidum,TP)屬于密螺旋體屬蒼白螺旋體的蒼白亞種，是引起人類梅毒的病原體，主要經(jīng)性接觸和輸血傳播，人是梅毒的唯一傳染源。我國(guó)TP感染率較高，國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道，我國(guó)西安地區(qū)159 902名自愿獻(xiàn)血者的檢測(cè)結(jié)果顯示，TP陽性率從2006年的0.24%上升到2010年的0.51%[1]。TP在感染人體時(shí)具有自然的潛在周期[2]，其診斷依據(jù)主要是血清學(xué)試驗(yàn)。血清學(xué)檢測(cè)方法包括快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(rapid plasma reagin circle card test，RPR)、TP顆粒凝集試驗(yàn)(treponema pallidum particle agglutination assay，TPPA)、化學(xué)發(fā)光微粒法(chemiluminescence microparticle immunoassay，CMIA)等，其中CMIA檢測(cè)抗TP抗體采用原始管上機(jī)，敏感性高，特異性好，適合大批量樣本檢測(cè)，目前被國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所使用。但在實(shí)際工作中，對(duì)于CMIA檢測(cè)的信號(hào)/臨界值(signal-to-cut off， S/CO)比值≥1.0的樣本都要求進(jìn)行復(fù)檢和確證試驗(yàn)，造成人力和和試劑的極大浪費(fèi)。鑒于此，我們統(tǒng)計(jì)2012年1月至2014年5月抗TP抗體復(fù)檢結(jié)果，以陽性預(yù)測(cè)值≥95%為目標(biāo)，確定初篩試驗(yàn)的復(fù)檢范圍和抗TP抗體臨床檢測(cè)操作流程，以期能為臨床合理選擇檢驗(yàn)項(xiàng)目、正確診斷和治療提供可靠的依據(jù)，同時(shí)可減少須進(jìn)行確證試驗(yàn)的樣本量。

材料和方法

一、樣本來源

2012年1月至2014年5月三峽大學(xué)仁和醫(yī)院住院及門診患者21 894例，年齡11~78歲，其中男10 804例，女11 090例。CMIA初檢S/CO比值≥1.0者630例，其中男352例，女278例。

二、 方法

1.樣本采集用促凝管采集患者空腹靜脈血5 mL，室溫靜置30 min，1 400×g離心10 min后原管上機(jī)，在2 h內(nèi)完成檢測(cè)，若非當(dāng)日檢測(cè)，樣本可在室溫儲(chǔ)存24 h或在2～8 ℃儲(chǔ)存7 d。

2.檢測(cè)方法、儀器和試劑 (1) 抗TP抗體篩查試驗(yàn)：采用CMIA進(jìn)行篩查，檢測(cè)結(jié)果S/CO比值≥1.0為抗TP抗體陽性反應(yīng)，<1.0為陰性反應(yīng)，i2000SR全自動(dòng)CMIA分析儀及其配套試劑(美國(guó)Abbott公司產(chǎn)品)。(2)抗TP抗體確證試驗(yàn)：采用免疫印跡法(western blotting，WB)進(jìn)行CMIA初檢和復(fù)檢呈陽性反應(yīng)樣本的結(jié)果驗(yàn)證，歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司(德國(guó))生產(chǎn)的抗TP抗體檢測(cè)試劑盒，按試劑說明書操作。

結(jié)果

一、初檢S/CO比值≥1.0的樣本CMIA復(fù)檢和WB復(fù)核結(jié)果

初檢S/CO比值≥1.0的630例樣本與CMIA復(fù)檢結(jié)果的總符合率為93.0%(586/630)，與WB結(jié)果的總符合率為75.9%(478/630)。CMIA復(fù)檢陽性樣本與WB結(jié)果的總符合率為81.6%(478/586)，凡WB確認(rèn)陽性的樣本CMIA復(fù)檢結(jié)果均呈陽性反應(yīng)。見表1。

表1　初篩呈陽性反應(yīng)的樣本CMIA復(fù)檢和WB確證試驗(yàn)結(jié)果(符合率)　[例(%)]

二、初檢S/CO比值≥1.0的樣本在各初檢S/CO比值區(qū)間內(nèi)CMIA復(fù)檢和WB復(fù)核結(jié)果

初檢S/CO比值在1.0~6.0范圍的樣本與CMIA復(fù)檢結(jié)果的符合率為80.1%(177/221)，CMIA初檢和復(fù)檢與WB結(jié)果的符合率分別為45.2(100/221)和56.5%(100/177)。初檢S/CO比值在6.1~8.0范圍的樣本與CMIA復(fù)檢結(jié)果的符合率為100.0%(94/94)，CMIA初檢和復(fù)檢與WB結(jié)果的符合率均為81.9%(77/94)。初檢S/CO比值1.0~8.0范圍的樣本與CMIA復(fù)檢結(jié)果的符合率為86.0%(271/315)，CMIA初檢和復(fù)檢與WB結(jié)果的符合率分別為56.2%(177/315)和65.3%(177/271)。初檢S/CO比值≥6.1的樣本與CMIA復(fù)檢結(jié)果的符合率為100.0%(409/409)，CMIA初檢和復(fù)檢與WB結(jié)果的符合率均為92.4%(378/409)。初檢S/CO比值≥8.1的樣本與CMIA復(fù)檢結(jié)果的符合率為100.0%(315/315)，CMIA初檢和復(fù)檢與WB結(jié)果的符合率均為95.6 %(301/315)。初檢S/CO比值≥9.1的樣本與CMIA復(fù)檢結(jié)果的符合率均為100.0%(230/230)，CMIA初檢和復(fù)檢與WB結(jié)果的符合率均為98.3 %(226/230)。見表1。

討論

CMIA檢測(cè)抗TP抗體已在國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用，但評(píng)價(jià)不一。袁明生[3]對(duì)CMIA檢測(cè)抗TP抗體的試驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，指出該方法與熒光抗TP抗體吸收試驗(yàn)(fluorescent treponemal antibody absorption,FIA-ABS)檢出率相當(dāng)，可以用于抗TP抗體的篩查，而譚延國(guó)等[4]在CMIA與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和TP血球凝集試驗(yàn)(treponema pallidum hemagglutination assay, TPHA)檢測(cè)抗TP抗體符合情況中發(fā)現(xiàn)，CMIA敏感性較高(接近100%)，重復(fù)性好，但特異性較低。雖然國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室遇到抗TP抗體陽性樣本時(shí)一般都采用TPPA來確認(rèn)，但TPPA檢測(cè)也存在一定的假陽性率[5]，或CMIA與TPPA聯(lián)合檢測(cè)后出現(xiàn)一些抗TP抗體陽性不確定的結(jié)果[6]，出現(xiàn)上述情況可能的原因是由于TPPA與CMIA檢測(cè)原理不同，TPPA是用密螺旋體本身作為抗原檢測(cè)血清的抗TP抗體，而CMIA采用的是TP15、TP17和TP47這3種經(jīng)典的診斷抗原來檢測(cè)，當(dāng)血清中抗體類型不全時(shí)，二者結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)差異，因此用TPPA作為抗TP抗體的確證試驗(yàn)存在不足。本研究采用WB做為抗TP抗體確證試驗(yàn)，WB是目前較為公認(rèn)的TP特異性抗體確證方法[7]，對(duì)梅毒的陽性診斷率達(dá)100%，其在試驗(yàn)操作過程中簡(jiǎn)便，陰陽性結(jié)果界線分明，易于判定[8]，但不適合大批量的樣本檢測(cè)。

在實(shí)際工作中，若對(duì)于初檢所有的有反應(yīng)性的樣本都進(jìn)行復(fù)檢并經(jīng)WB確認(rèn)，勢(shì)必會(huì)增加成倍的工作量和試劑的浪費(fèi)。國(guó)外學(xué)者報(bào)道，抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)/人類獲得性免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)抗體檢測(cè)的S/CO比值與是否需要進(jìn)一步確證具有相關(guān)關(guān)系，可用S/CO比值的高低來決定是否需要做確證試驗(yàn)[9]。另一項(xiàng)研究也提示，S/CO比值>均值能夠用來預(yù)測(cè)補(bǔ)充確證試驗(yàn)的陽性結(jié)果[10]。因此，我們借鑒抗HCV抗體和抗HIV抗體篩查試驗(yàn)程序，探討CMIA檢測(cè)抗TP抗體的復(fù)檢流程。

CMIA檢測(cè)抗TP抗體分析結(jié)果顯示， S/CO比值>8.1以上的樣本315例，與CMIA復(fù)檢的符合率為100.0%，與WB的符合率為95.6%。因此，以陽性預(yù)測(cè)值≥95%為目標(biāo)，對(duì)于S/CO比值≥8.1的樣本無需CMIA復(fù)檢，可直接發(fā)出報(bào)告，結(jié)果報(bào)告應(yīng)附有未進(jìn)行旁證試驗(yàn)的注釋。對(duì)于S/CO比值≥8.1結(jié)果的解釋，提示機(jī)體既往感染或現(xiàn)在感染TP，未作血清學(xué)補(bǔ)充試驗(yàn)。S/CO比值≥8.1的樣本可報(bào)告陽性(陽性預(yù)測(cè)值>95%)，但尚有<5%的可能為假陽性，如有需要，可要求進(jìn)行特異性更好的補(bǔ)充試驗(yàn)。對(duì)于S/CO比值在1.0~8.0范圍的樣本，先經(jīng)CMIA復(fù)檢，仍呈陽性反應(yīng)者用WB確認(rèn)。因其中有假陽性，如果不加以鑒別，發(fā)出報(bào)告，可能會(huì)產(chǎn)生醫(yī)療糾紛和造成臨床科室對(duì)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的不信任。若以陽性預(yù)測(cè)值≥98%為目標(biāo)，則應(yīng)將無需復(fù)檢的S/CO比值定為≥9.1，并在檢測(cè)報(bào)告中作出假陽性率的相應(yīng)提示。另有文獻(xiàn)報(bào)道，老年人和某些疾病產(chǎn)生的某些干擾物質(zhì)會(huì)影響CMIA的準(zhǔn)確性，CMIA測(cè)得的呈陽性反應(yīng)的結(jié)果并非都是真陽性，必須通過復(fù)檢和/或確證試驗(yàn)加以鑒別[11]。本研究結(jié)果顯示，我們?cè)O(shè)計(jì)并提出復(fù)檢流程，根據(jù)初檢S/CO比值的范圍選擇復(fù)檢試驗(yàn)，見圖1，對(duì)于有條件的實(shí)驗(yàn)室可以選擇WB證實(shí)，未開展WB的實(shí)驗(yàn)室，也可以選擇TPPA來初步確認(rèn)，但對(duì)于CMIA與TPPA不相符的結(jié)果，可在報(bào)告單備注中說明陽性結(jié)果只提示所測(cè)樣本中有抗類脂抗體或抗TP抗體存在，不能作為患者感染TP的絕對(duì)依據(jù)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床綜合分析。

綜上所述，我們根據(jù)S/CO比值的范圍設(shè)計(jì)的復(fù)檢流程是建立在陽性預(yù)測(cè)值不低于95%的基礎(chǔ)上，故仍有一定的誤診率，尚需大樣本來充實(shí)資料并驗(yàn)證，進(jìn)一步探索和總結(jié)，優(yōu)化復(fù)檢流程，以期為臨床提供更準(zhǔn)確的報(bào)告。

圖1　建議CMIA檢測(cè)抗TP抗體陽性樣本的復(fù)檢流程

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(本文編輯：姜敏)

楊華，楊曉東，饒麗華

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 宜昌 443001)

摘要：目的探討化學(xué)發(fā)光微粒法(CMIA)檢測(cè)抗梅毒螺旋體(TP)抗體的復(fù)檢范圍并進(jìn)行流程改進(jìn)分析。方法21 894份血清樣本用CMIA篩查抗TP抗體，呈陽性反應(yīng)的樣本用CMIA相同廠家、相同批號(hào)的試劑復(fù)檢，以免疫印跡法(WB)為確證試驗(yàn)。以信號(hào)/臨界值(S/CO)比值進(jìn)行分段統(tǒng)計(jì)。結(jié)果21 894份血清樣本中CMIA初檢陽性630例，按照CMIA初檢抗TP抗體S/CO比值將樣本分為7組：1.0~2.0、2.1~4.0、4.1~6.0、6.1~8.0、8.1~9.0、9.1~10.0、>10.1。各組CMIA復(fù)檢結(jié)果符合率分別為62.5%(40/64)、80.0%(60/75)、93.9%(77/82)、100.0%(94/94)、100.0%(85/85)、100.0%(50/50)和100.0%(180/180)。各組CMIA復(fù)檢結(jié)果與WB符合率分別為 35.0%(14/40)、46.7%(28/60)、75.3%(58/77)、81.9%(77/94)、88.2%(75/85)、96.0%(48/50)和98.8%(178/180)。結(jié)論在規(guī)范操作的前提下，以陽性預(yù)測(cè)值≥95%為目標(biāo)，CMIA篩查抗TP抗體的復(fù)檢范圍S/CO比值設(shè)定為1.0~8.0，若S/CO比值≥8.1，可直接發(fā)出報(bào)告；1.0≤S/CO比值≤8.0，須采用WB確證，這樣既能保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，又可減少須進(jìn)行確證試驗(yàn)的樣本量。

關(guān)鍵詞：抗梅毒螺旋體抗體；復(fù)檢；范圍；化學(xué)發(fā)光微粒法；免疫印跡法

Investigation on the retesting procedure of anti-TP antibody determined by chemiluminescence microparticle immunoassayYANGHua，YANGXiaodong，RAOLihua. (DepartmentofClinicalLaboratory，RenheHospitalofChinaThreeGorgesUniversity，HubeiYichang443001，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the retesting range of ani-treponema pallidum (TP) antibody determined by chemiluminescence microparticle immunoassay (CMIA) and improve the retesting procedure. MethodsA total of 21 894 serum samples were screened by CMIA, the positive samples were retested duplicately by the same reagent kit of the same lot number and confirmed by western blotting (WB). The detection results were classifed into several groups for further analysis according to signal-to-cut off (S/CO) ratios. ResultsIn 21 894 serum samples, 630 cases were positive by CMIA. The samples were classified into 7 groups according to S/CO ratios：1.0-2.0, 2.1-4.0, 4.1-6.0, 6.1-8.0, 8.1-9.0, 9.1-10.0 and>10.1. The retesting coincidence rates by CMIA were 62.5%(40/64), 80.0%(60/75), 93.9%(77/82), 100.0%(94/94), 100.0%(85/85), 100.0%(50/50)and 100.0%(180/180).The coincidence rates for retesting by WB and CMIA were 35.0%(14/40)， 46.7%(28/60)，75.3%(58/77)， 81.9%(77/94)， 88.2%(75/85)， 96.0%(48/50) and 98.8%(178/180). ConclusionsThe S/CO ratio for retesting range by CMIA for the determination of anti-TP antibody is considered appropriate from 1.0-8.0 under a standardized laboratory condition and positive predictive value≥95% . Reports can be sent directly with S/CO ratio≥8.1. WB should be employed to confirmation assay with 1.0≤S/CO ratio ≤8.0. The appropriate retesting range not only can assure the accuracy of testing results, but also can reduce the sample numbers of confirmation assay.

Key words:Ani-treponema pallidum antibody; Retesting; Range; Chemiluminescence microparticle immunoassay; Western blotting

收稿日期：(2014-09-16)

作者簡(jiǎn)介：楊華，男，1983年生，學(xué)士，主管技師，主要從事臨床生化檢驗(yàn)工作。

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)12-1181-04R446.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.004