劉洪正，　王玉亮

子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個(gè)核細(xì)胞Fas的表達(dá)及意義

劉洪正1，王玉亮2

(1. 天津市濱海新區(qū)漢沽中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300480；

2. 天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

摘要：目的探討子宮內(nèi)膜異位癥與Fas介導(dǎo)的腹腔液單個(gè)核細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法選取手術(shù)后病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜異位癥的患者55例作為子宮內(nèi)膜異位癥組，以非子宮內(nèi)膜異位癥患者52例作為對(duì)照組，分離腹腔液單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定Fas mRNA的表達(dá)水平，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)Fas表達(dá)細(xì)胞百分率。結(jié)果子宮內(nèi)膜異位癥組腹腔液單個(gè)核細(xì)胞Fas mRNA及Fas表達(dá)細(xì)胞百分率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，F(xiàn)as mRNA及Fas表達(dá)細(xì)胞百分率在子宮內(nèi)膜異位癥組Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個(gè)核細(xì)胞Fas表達(dá)異常，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥具有一定的作用。

關(guān)鍵詞：Fas；單個(gè)核細(xì)胞；腹腔液；子宮內(nèi)膜異位癥

Expression of Fas in peritoneal fluid mononuclear cells among endometriosis patients and its significanceLIUHongzheng1，WANGYuliang2

.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HanguChineseMedicineHospitalofTianjinBinhaiNewArea,Tianjin300480,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinFirstCentralHospital,KeyLaboratoryforCriticalCareMedicineoftheMinistryofHealth,Tianjin300192,China)

Abstract:Objective To investigate the relationship of Fas expression in peritoneal fluid mononuclear cells and endometriosis. MethodsA total of 55 patients with histopathologically diagnosed endometriosis after operation were enrolled as endometriosis group, and 52 patients without endometriosis were enrolled as control group. The peritoneal fluid mononuclear cells were isolated, the expression levels of Fas mRNA were determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR), and the percentage of Fas expression cells were quantitatively detected by flow cytometry. ResultsFas mRNA and the percentage of Fas expression cells were significantly higher in endometriosis group than those in control group(P<0.05). There was no statistical significance between stage Ⅰ-Ⅱand stage Ⅲ-Ⅳ(P>0.05). ConclusionsThe abnormal Fas expression in peritoneal fluid mononuclear cells may play an important role in endometriosis.

Key words:Fas; Mononuclear cell; Peritoneal fluid; Endometriosis

細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除感染、變異、衰老的細(xì)胞，維持自身正常生理平衡的一種調(diào)節(jié)方式。Fas/FasL是引起細(xì)胞凋亡的重要通路之一，也是殺傷性T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的三大途徑之一[1]。Fas/FasL系統(tǒng)對(duì)于正常人體的發(fā)育、器官分化、免疫調(diào)節(jié)等一系列重要生理功能都是必不可少的，其異常與腫瘤、自身免疫疾病、移植排斥等發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[2-4]。子宮內(nèi)膜異位癥多發(fā)生于育齡期婦女，近年來發(fā)病有明顯上升趨勢(shì)[5]，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者與正常人內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡率存在顯著差異，異位的子宮內(nèi)膜細(xì)胞表現(xiàn)過度增殖及凋亡異?？赡苁亲訉m內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一[6]。我們通過檢測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個(gè)核細(xì)胞Fas的表達(dá)水平，探討Fas介導(dǎo)的腹腔液單個(gè)核細(xì)胞凋亡在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用。

材料和方法

一、材料

1. 研究對(duì)象選取2010至2014年上半年在天津市濱海新區(qū)漢古中醫(yī)院、天津市第一中心醫(yī)院婦科行腹腔鏡或開腹手術(shù)并術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)的子宮內(nèi)膜異位癥患者55例作為子宮內(nèi)膜異位癥組，平均年齡(36±6)歲；用修訂后的美國生育協(xié)會(huì)內(nèi)異癥分期評(píng)分法對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥組患者進(jìn)行分期，38例為Ⅰ～Ⅱ期(輕度內(nèi)異癥組)，17例為Ⅲ～Ⅳ期(重度內(nèi)異癥組)。選取同期住院行腹腔鏡手術(shù)的非子宮內(nèi)膜異位癥患者52例作為對(duì)照組，無盆腔炎癥，平均年齡(34±6)歲。兩組采樣前3個(gè)月均未接受激素類藥物治療，年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者進(jìn)行知情告知并簽署知情同意書。

2. 標(biāo)本收集子宮內(nèi)膜異位癥組與對(duì)照組于術(shù)中無菌吸取子宮直腸陷凹處的腹腔液，注意操作時(shí)避免血液流入腹腔，有血液污染則棄去不用，分別分離出腹腔液單個(gè)核細(xì)胞。

3. 試劑與儀器總RNA抽提試劑TRIzol(美國GIBCO-BRL公司)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)，聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)，F(xiàn)as、β-actin引物序列(美國Applied Biosystems公司)，異氰酸熒光素(FITC)-小鼠抗人Fas單克隆抗體(美國Becton Dickinson公司)，ABI 7300 PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

二、方法

1. 腹腔液單個(gè)核細(xì)胞表面Fas分子的定量檢測(cè)[7]將采集的腹腔液經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，加入熒光素異氰酸熒光素(FITC)-小鼠抗人Fas單克隆抗體，孵育30 min，用PBS洗滌2次后制成懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定并計(jì)算Fas表達(dá)細(xì)胞的百分率。

2. 腹腔液單個(gè)核細(xì)胞FasmRNA的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR測(cè)定FasmRNA。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄酶說明書操作合成cDNA。Fas上游引物序列：5′-AAGACTGTTACTACAGTTG-3′，下游引物序列：5′-GCTTATGGCAGAATTGGCCA-3′；β-actin上游引物序列：5′-GATGGCCACGGCTGCTT-3′，下游引物序列：5′-ACCGCTCATTGCCAATGGT-3′；實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，20×SYBR Green Ⅰ液1 μL，Taq酶1 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為93℃ 2 min，然后93℃ 60 s，50℃ 60 s，72℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。為消除標(biāo)本處理、逆轉(zhuǎn)錄和PCR的差異，以2-ΔCt表示Fas mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,其中ΔCt=CtFas-Ctβ-actin。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、子宮內(nèi)膜異位癥組和對(duì)照組腹腔液單個(gè)核細(xì)胞FasmRNA及Fas表達(dá)細(xì)胞百分率的比較

子宮內(nèi)膜異位癥組腹腔液單個(gè)核細(xì)胞FasmRNA的表達(dá)水平及Fas表達(dá)細(xì)胞百分率均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，見表1。

二、子宮內(nèi)膜異位癥Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期腹腔液單個(gè)核細(xì)胞FasmRNA表達(dá)水平及Fas表達(dá)細(xì)胞百分率的比較

Ⅰ～Ⅱ期子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個(gè)核細(xì)胞FasmRNA表達(dá)水平及Fas表達(dá)細(xì)胞百分率與Ⅲ～Ⅳ期患者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1　兩組腹腔液單個(gè)核細(xì)胞Fas mRNA

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見良性卻有惡性行為的婦科疾病，近年來發(fā)病有明顯上升趨勢(shì)[8]。研究證實(shí)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生與細(xì)胞免疫密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、殺傷性T淋巴細(xì)胞對(duì)于異位內(nèi)膜細(xì)胞的殺傷活性降低，從而降低了機(jī)體對(duì)異位子宮內(nèi)膜的免疫監(jiān)視、識(shí)別和破壞，不能有效阻止異位內(nèi)膜細(xì)胞在腹腔中的種植及生長，促進(jìn)了內(nèi)膜異位病灶的形成[9]。

Fas是一種相對(duì)分子質(zhì)量為48 000的 Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，為介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要膜表面死亡分子。FasL為Fas的配體。當(dāng)免疫活性細(xì)胞表面的膜分子FasL與靶細(xì)胞上的Fas結(jié)合后，啟動(dòng)凋亡信號(hào)的跨膜傳遞，F(xiàn)as分子胞漿段內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白結(jié)合，并激活天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致caspase3的激活和一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而啟動(dòng)表達(dá)Fas細(xì)胞的凋亡[10]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜細(xì)胞與正常人內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率有明顯差異，常伴有異位內(nèi)膜細(xì)胞Fas表達(dá)缺失、異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡降低以及腹腔淋巴細(xì)胞凋亡升高[11]。本研究結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個(gè)核細(xì)胞FasmRNA及Fas表達(dá)細(xì)胞百分率明顯升高，但與臨床分期無關(guān)。當(dāng)這些表達(dá)Fas的免疫細(xì)胞與表達(dá)FasL的異位內(nèi)膜細(xì)胞結(jié)合后，可能會(huì)激活Fas/FasL凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而使高表達(dá)Fas的免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而影響了微環(huán)境的免疫防御機(jī)制。因此，免疫細(xì)胞無法殺傷內(nèi)膜增生細(xì)胞，為異位內(nèi)膜細(xì)胞的種植和生長提供有利條件，使逆流至腹腔中的內(nèi)膜細(xì)胞逃避免疫殺傷而易于存活[12]。而表達(dá)FasL的腹腔液淋巴細(xì)胞也可通過旁分泌形式導(dǎo)致相鄰的Fas陽性淋巴細(xì)胞凋亡，也可通過自分泌形式自殺，使免疫監(jiān)視、免疫殺傷功能減弱而不能有效地清除異位內(nèi)膜細(xì)胞。因此，F(xiàn)as/FasL引起的腹腔液免疫細(xì)胞凋亡可能在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

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(本文編輯：儲(chǔ)怡星)

收稿日期：(2014-12-12)

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)05-0454-03R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.011

通訊作者：王玉亮，聯(lián)系電話：022-23728992。

作者簡介：劉洪正，男，1966年生，主管技師，主要從事臨床免疫檢驗(yàn)工作。