葉翔宇　楊志清　陳建華　劉娟娟　陳鳳鳴　金環(huán)

摘要：基于酶專一性催化機(jī)理，通過纖維素酶對纖維素纖維的選擇性降解/溶解過程，本文首次探討了纖維素酶在纖維素纖維含量檢測上的應(yīng)用前景。以棉貼襯為研究對象，通過單因素試驗方案設(shè)計，獲得了最佳酶催化條件。進(jìn)一步在最佳催化條件下，通過稱重法、SEM、ATR和XRD等手段考察了纖維素酶催化過程中棉貼襯和粘膠貼襯的質(zhì)量損失曲線，纖維表面形貌、化學(xué)組成和結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化，并通過對腈綸貼襯、滌綸貼襯和羊毛貼襯的降解試驗驗證了纖維素酶專一性。初步結(jié)果表明，纖維素酶有望應(yīng)用于紡織品中粘膠纖維含量的檢測，為建立新型紡織品纖維定量分析的綠色酶法開辟了新思路。

關(guān)鍵詞：纖維含量；定量分析；纖維素酶；酶法檢測

1 引言

紡織品中纖維成分含量，是評價紡織品質(zhì)量的主要指標(biāo)，也是紡織檢測機(jī)構(gòu)業(yè)務(wù)量占比最大的項目之一。目前使用最為廣泛的定量分析方法為化學(xué)溶解法[1]，其利用不同纖維成分在溶劑中溶解性的差異，通過溶解去除可溶組分同時不損傷其他纖維（即選擇性溶解），進(jìn)行質(zhì)量比例分析。委托樣品中又以天然紡織原料纖維素纖維如棉、麻、粘膠纖維、莫代爾纖維等居多，與之相關(guān)的主要有硫酸法[2]、鋅酸鈉法[3]、甲酸-氯化鋅法[4]等3種。

但是目前化學(xué)溶解法測試?yán)w維素纖維含量存在一些問題。以硫酸法為例，它所使用的溶劑為濃度為75%的濃硫酸，具強(qiáng)腐蝕性以及接觸皮膚脫水碳化危險，清洗過程中必須保證將硫酸完全去除，否則干燥過程中殘留微量硫酸濃度變高就會將殘留樣品碳化，因此清洗過程需要用大量清水進(jìn)行沖洗，并用氨水進(jìn)行中和，氣味強(qiáng)烈。硫酸使用量很大，會產(chǎn)生大量有毒有害廢水排放，廢液處理成本較高，還會腐蝕儀器設(shè)備。此外75%硫酸溶液溶解能力強(qiáng)專一性差，可溶解蠶絲、腈綸、錦綸、氨綸、維綸等，使得對三組分及以上紡織樣品的含量測定困難。鑒于此，發(fā)展一種綠色無害、條件溫和、過程簡單、溶解專一性好的纖維素纖維含量檢測方法十分必要。酶是一種高效生物催化劑，具有很高的催化專一性。同時酶促反應(yīng)多在常溫常壓、弱酸弱堿或中性條件下進(jìn)行，反應(yīng)溶劑多為水，無腐蝕性。酶的這些特點(diǎn)，使得它在紡織纖維成分的定量檢測領(lǐng)域有潛在應(yīng)用。

纖維素酶Cellulase，編號EC3.2.1.4，是由多種水解酶組成的一個復(fù)合酶系，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶，可將纖維素選擇性降解成葡萄糖。纖維素酶的降解作用機(jī)制，主要有C1—Cx假說、順序作用假說和協(xié)同降解假說，目前普遍認(rèn)可的是協(xié)同作用模型：內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定形區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈末端；外切葡聚糖酶作用于這些鏈末端，產(chǎn)生纖維二糖或葡萄糖；葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖[5]。纖維素酶為我國第一大工業(yè)酶種，國內(nèi)年產(chǎn)量在2000噸以上，其用于處理廢舊纖維素制品早在上世紀(jì)70年代就有報道[6]。目前纖維素酶已廣泛應(yīng)用在紡織品加工領(lǐng)域，如棉麻織物后整理、牛仔布酶洗、織物減量處理、生物拋光等，需要控制降解程度，使得在不損壞纖維強(qiáng)度的前提下，改善紡織品性能。纖維素酶的另一個重要用途就是生物燃料乙醇，利用纖維素酶將生物纖維質(zhì)如稻草秸稈、玉米稈、木渣等完全降解為葡萄糖后，用于發(fā)酵生產(chǎn)[7]。對于紡織品含量檢測而言，并不需要將棉、粘膠纖維等完全降解為小分子糖類物質(zhì)，只需將纖維素成分部分降解為能溶解在水中的寡糖片段，能進(jìn)行簡單分離即可，此工作尚未得到大家關(guān)注。

本文利用纖維素酶的專一催化降解特性，首次探討了其在纖維素纖維含量檢測領(lǐng)域的應(yīng)用前景，并對最佳酶催化條件、酶催化過程及催化專一性等問題進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期建立一種新型綠色酶法紡織品成分定量分析技術(shù)，取代現(xiàn)有危險性有機(jī)溶劑濃硫酸的使用。

2 試驗部分

2.1 材料

酸性纖維素酶（Primafast 200），由Genencor （Wuxi） Bio-Products Co.， Ltd提供，為復(fù)合酶制劑，外觀為棕色液體。棉貼襯、粘膠貼襯、腈綸貼襯、滌綸貼襯、羊毛貼襯（滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 7568—2008 《紡織品 色牢度試驗 標(biāo)準(zhǔn)貼襯織物》要求）購于杭州天天檢科技開發(fā)中心。檸檬酸、檸檬酸三鈉、醋酸、三水醋酸鈉、磷酸氫二鈉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，直接使用。配制緩沖溶液所用的水為超純水。

2.2 纖維素酶催化試驗

緩沖溶液配制：分別配制pH值為4.8，離子強(qiáng)度為25 mM、50mM、75mM、100mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液；pH值為4.8，離子強(qiáng)度為50 mM的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液。當(dāng)離子強(qiáng)度為50mM，定容到1000mL時，配比分別為檸檬酸4.83g-檸檬酸三鈉7.94g，醋酸2.31mL-三水醋酸鈉8.16g，檸檬酸5.33g-磷酸氫二鈉7.00g。

典型酶催化試驗過程：用天平（瑞士梅特勒公司，ME204）稱取1.0g貼襯，放入100mL錐形瓶中，然后加入30mL酶溶液，緩沖液為pH值4.8，離子強(qiáng)度50mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液，酶量為0.3mL，將錐形瓶放進(jìn)溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為50rpm的恒溫水浴振蕩器中，振蕩反應(yīng)24h后取出抽濾，并用超純水清洗1次后將殘留物放入105℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥完全后稱重，根據(jù)質(zhì)量變化計算質(zhì)量下降率（weight reduction ratio）。在高溫干燥過程中，酶會完全失活，不需擔(dān)心可能的殘留酶對織物質(zhì)量下降率的影響。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，每批次做兩個平行樣，取平均值。

通過單因素試驗方案設(shè)計，分別考察離子強(qiáng)度、緩沖液體系、酶量、浴比、反應(yīng)溫度等參數(shù)對酶催化活性的影響，獲得最佳條件。在最佳酶催化條件下，得到貼襯質(zhì)量下降率-時間曲線；以及不同纖維貼襯在纖維素酶催化反應(yīng)24h后的質(zhì)量下降率，考察纖維素酶法檢測專一性。

2.3 測試表征

表征棉和粘膠貼襯在催化過程中纖維表面形貌、化學(xué)組成和結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化，具體測試條件如下：endprint

美國Phenom Pro臺式掃描電鏡SEM，樣品預(yù)先用導(dǎo)電雙面膠固定在樣品臺上，在10mA電流下噴金30s提高導(dǎo)電性，加速電壓設(shè)定為5kV，image電子束流，背散射電子（BSE）探測器成分模式（Full）成像，拍攝不同放大倍數(shù)的電鏡照片。

美國Nicolet 6700型傅立葉紅外光譜儀，內(nèi)反射元件Ge晶體。測試時，樣品表面緊貼Ge晶體表面，壓緊，選擇表面衰減全反射ATR模式，設(shè)置掃描精度為2cm-1，掃描次數(shù)為32次。

德國Bruke D2 Phaser X射線衍射儀XRD，X射線源為Cu靶，Kα射線，電壓30kV，電流10mA，貼襯樣品平鋪在有機(jī)玻璃樣品臺上，掃描范圍為8 o～60o，步長0.02o，掃描速度10o/min，樣品臺轉(zhuǎn)速15 rpm。

3 結(jié)果與討論

3.1 最適纖維素酶催化條件

棉貼襯為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，因此以棉貼襯為研究對象，探討不同參數(shù)對酶催化活性的影響，恒溫水浴振蕩器轉(zhuǎn)速固定為50rpm，反應(yīng)時間固定為24h，以期得到最適纖維素酶催化條件。

3.1.1 緩沖液體系

首先依據(jù)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 2583—2003《纖維素酶制劑》附錄A濾紙酶活力測定方法中適合酸性纖維素酶的條件，以及公司提供的產(chǎn)品說明書，選取pH值4.8（最適pH）的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，在40℃和50℃下考察離子強(qiáng)度對酶活性的影響，其他條件固定為30mL酶溶液，0.3mL酶量，結(jié)果如圖1（a）所示。pH值數(shù)值的變化不僅影響纖維素酶的活力，還影響酶的穩(wěn)定性，只有在最適pH值下，酶分子處于最佳的電離狀態(tài)，因此需要緩沖液具有足夠的緩沖容量，以便pH值保持穩(wěn)定。當(dāng)離子強(qiáng)度在50mM時，具有最大的酶活力，75mM活力與50mM接近，而離子強(qiáng)度為25mM和100mM時，活性稍差。離子強(qiáng)度為0mM，即僅僅使用超純水時，酶活性最低，且50℃下的酶活性比40℃低，而在緩沖液體系中，50℃下的酶活性均比40℃高，說明緩沖鹽起到了穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的作用。

在pH值4.8、離子強(qiáng)度為50mM、反應(yīng)溫度為50℃的情況下，考察緩沖液種類的影響，如圖1（b）所示，發(fā)現(xiàn)酶活性在不同緩沖液種類中差別不大，超純水中活性只有緩沖液中一半左右，按如下順序排列：檸檬酸-檸檬酸三鈉>檸檬酸-磷酸氫二鈉>醋酸-醋酸鈉>超純水。因此，緩沖液體系確立為pH值4.8，離子強(qiáng)度50mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液。

3.1.2 溶液組成

本試驗中纖維不溶于水，為典型的非均相催化反應(yīng)，進(jìn)一步考察在40℃和50℃下酶量和浴比對酶催化活性的影響。酶溶液總量固定為30mL，酶量影響結(jié)果如圖2（a）所示。發(fā)現(xiàn)50℃下的酶活性均比40℃高，酶量在0.3mL時，貼襯質(zhì)量下降率最高，這是因為一定量纖維素能和酶分子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量有限，當(dāng)這些位點(diǎn)全部被占據(jù)后，再增加酶用量，將起不到酶解作用，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，酶量確定為1.0g貼襯/0.3mL酶量。固定酶量為0.3mL，考察浴比的影響，如圖2（b）所示，發(fā)現(xiàn)50℃下的酶活性均比40℃高，酶溶液為30mL時，貼襯質(zhì)量下降率最高。主要有兩方面原因，一是酶溶液量少時，會發(fā)生產(chǎn)物抑制效應(yīng)；二是酶溶液量增加時，酶濃度降低，減弱酶向纖維表面的擴(kuò)散，兩方面因素共同作用下，最佳酶溶液添加量確立為1.0g貼襯/0.3mL酶量/30mL酶溶液。

3.1.3 反應(yīng)溫度

最后本文探討了反應(yīng)溫度的影響，如圖3所示，最佳反應(yīng)溫度為50℃。隨溫度增加，分子運(yùn)動加速，酶反應(yīng)還存在活化能，因此在一定溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)隨溫度的升高速度加快。但酶是蛋白質(zhì)，在一定溫度條件下會變性失活，因此當(dāng)反應(yīng)溫度提高到60℃時，貼襯質(zhì)量下降率反而從50℃時的25.2%降低到了2.7%。

根據(jù)以上試驗結(jié)果，確定最適纖維素酶催化條件：緩沖液為pH值4.8，離子強(qiáng)度50mM的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液，酶量為0.3mL，酶溶液為30mL，反應(yīng)溫度為50℃。反應(yīng)24h，棉貼襯的質(zhì)量下降率在25%左右。在最佳條件下反應(yīng)24h，粘膠貼襯質(zhì)量下降率為100%，可完全降解為可溶物。

3.2 酶催化過程研究

在最佳纖維素酶催化條件下，探討了棉貼襯和粘膠貼襯質(zhì)量下降率隨時間的變化，如圖4（a）和（b）所示。棉貼襯質(zhì)量下降率隨著時間延長，呈線性增加趨勢，說明此時棉纖維相較酶量一直處于過量狀態(tài)，酶催化降解速度保持恒定，但催化降解速率較慢，48h后質(zhì)量下降率才為33.8%。粘膠纖維則不同，4h之后質(zhì)量下降率就達(dá)到了38.6%，16h后為90.7%，24h后已經(jīng)完成降解為可溶性物質(zhì)。這主要是由于兩者結(jié)構(gòu)不同所致。天然棉纖維中纖維素聚合度在6000～11000之間，結(jié)晶度高；而粘膠纖維屬再生纖維素纖維，它是以天然纖維素為原料，經(jīng)堿化、老化、磺化等工序制成可溶性纖維素黃原酸酯，再溶于稀堿液制成粘膠，經(jīng)濕法紡絲而制成，其纖維素聚合度為500～1000之間，結(jié)晶度低。因此纖維素酶對粘膠貼襯表現(xiàn)出了更強(qiáng)的降解能力。

通過SEM、ATR和XRD對降解過程中棉和粘膠貼襯的表面形貌、化學(xué)組成和結(jié)晶結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析。

從圖5的SEM圖可以發(fā)現(xiàn)棉貼襯結(jié)構(gòu)緊密，棉纖維縱向呈扁平的轉(zhuǎn)曲帶狀，表面略有褶皺；纖維素酶催化24h后，棉貼襯表面斷裂纖維增多，纖維表面出現(xiàn)了破碎開孔結(jié)構(gòu)，起到類似剝皮效果；48h后，棉貼襯表面斷裂纖維繼續(xù)增多，纖維表面出現(xiàn)大量的破碎開孔結(jié)構(gòu)，部分纖維已經(jīng)完全斷裂。粘膠貼襯結(jié)構(gòu)緊密，粘膠纖維呈圓形，表面有許多不規(guī)則溝槽；8h后粘膠貼襯結(jié)構(gòu)變松散，粘膠纖維分裂為多根細(xì)絲；16h后粘膠貼襯已無法看出明顯的編織結(jié)構(gòu)，2000x下看，除了多根細(xì)絲，還出現(xiàn)了非常多的小碎片。

ATR結(jié)果如圖6所示，棉貼襯和粘膠貼襯均為典型的纖維素纖維紅外譜圖，3330cm-1處為O—H基振動峰，2900cm-1處為C—H基振動峰，1650cm-1處是由于水分而引起的吸收峰，在1160cm-1～900cm-1之間的四個峰為—C—O—C—的振動峰，這些峰為纖維素的特征峰[8]。棉貼襯和粘膠貼襯在降解過程中，譜圖形狀均沒有發(fā)生變化，說明酶催化降解過程中沒有產(chǎn)生新物質(zhì)或新官能團(tuán)。貼襯經(jīng)過酶降解后，O—H峰和—C—O—C—特征峰以及水吸收峰變明顯，和SEM結(jié)果相對應(yīng)，說明降解過程中，棉貼襯中纖維素分子組分暴露，同時兩種貼襯發(fā)生降解，聚合度下降，使得端O—H量增加，吸濕性也增加。endprint

棉貼襯降解過程中纖維素纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)變化結(jié)果如圖7（a）所示。棉貼襯在2θ為14.90o、16.50o、22.75o、34.26o處出現(xiàn)了4個特征衍射峰，分別對應(yīng)于纖維素Ι型的（101）、（10ī）、（002）、（040）晶面，說明酶降解過程保持了天然纖維素的Ι型結(jié)構(gòu)[9]。粘膠纖維貼襯因降解后形貌變化較大，因此只測試了未降解樣品[圖7（b）]，可以發(fā)現(xiàn)在2θ在12.25o、19.78o、21.72o處出現(xiàn)了3個特征衍射峰，為纖維素IΙ型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。通過Bruker EVA軟件對結(jié)晶度進(jìn)行半定量分析（表1），可以發(fā)現(xiàn)粘膠貼襯的結(jié)晶度為31.2%，棉貼襯的結(jié)晶度為46.8%，反應(yīng)24h后結(jié)晶度為36.8%，48h后的結(jié)晶度為32.5%，說明酶催化降解過程打破了原有的棉天然纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使其結(jié)晶度降低，但不會改變晶型。

纖維素酶分子由具有催化功能的催化結(jié)構(gòu)域CD、肽連接橋和具有結(jié)合纖維素功能的纖維素結(jié)合域CBD等三部分組成[10]。結(jié)合前人工作基礎(chǔ)[5，7，10]，并綜合以上試驗結(jié)果，推測酶催化過程為：由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成復(fù)合物的過程，纖維素酶首先特異性地吸附在底物纖維素上，CBD嵌入到纖維素結(jié)晶鏈段區(qū)域，使其無定型化，結(jié)晶度降低，結(jié)晶鏈段開始溶脹和分散，但不會發(fā)生晶型改變以及產(chǎn)生新的官能團(tuán)；同時各種酶開始協(xié)同模式降解，使貼襯質(zhì)量下降，纖維表面出現(xiàn)了類似剝皮的刻蝕效果；粘膠纖維因有溶解再生的過程，聚合度和結(jié)晶度低，因此在24h后可被完全降解完全，棉纖維則隨著降解過程的進(jìn)行，從外向內(nèi)不斷被刻蝕減重。

3.3 專一性分析

混紡織物中不同纖維含量的確定，主要基于“溶解性質(zhì)”的差異，若在某一溶劑中除目標(biāo)纖維外其他纖維也會部分溶解，則在計算含量時用不等于1的質(zhì)量修正值d進(jìn)行修正，因此對于溶解過程的溫度、時間，甚至溶解過程中的手動振蕩次數(shù)等均有嚴(yán)格要求，容易產(chǎn)生試驗偏差。進(jìn)一步考察了纖維素酶對不同纖維貼襯的催化專一性，結(jié)果如表2所示，可以看到，除了對棉和粘膠等纖維素類纖維具有催化降解性能之外，對于羊毛、聚丙烯腈、聚酯等纖維不會產(chǎn)生質(zhì)量損失，具有優(yōu)良的催化專一性。將粉碎后的粘膠貼襯和聚酯貼襯按照不同質(zhì)量配比混勻，進(jìn)行含量測試，發(fā)現(xiàn)測試結(jié)果均與投料比吻合。

4 結(jié)論與展望

纖維素酶對不同標(biāo)準(zhǔn)貼襯的降解結(jié)果表明，纖維素酶有望用于紡織品中粘膠纖維含量的定量檢測，但本試驗中纖維素酶所需催化降解時間較長，造成檢測效率偏低，需對酶及復(fù)合酶制劑做進(jìn)一步篩選。以下問題也有待進(jìn)一步研究深入：首先是隨著纖維素酶活的儲存穩(wěn)定性；其次經(jīng)過助劑后整理和煮練、印染等過程的面料，其對酶活和降解過程的影響有待探討；對麻纖維，竹纖維和醋酯纖維的降解能力有待研究；對于其他再生纖維素纖維，如銅氨纖維、莫代爾纖維、天絲纖維等是否具有同樣的催化降解效果，還有經(jīng)過回收處理的再加工纖維，可否利用晶型結(jié)構(gòu)、纖維形貌及纖維素酶催化降解過程差異等進(jìn)行定性鑒別；基于同樣的酶專一性催化降解機(jī)理，脂肪酶和蛋白酶是否可用于聚酯類以及蛋白類如羊毛、蠶絲等纖維含量的定量分析。本工作的最終目標(biāo)是通過纖維素酶、脂肪酶、酰胺酶和蛋白酶等不同酶組合，對纖維素纖維、聚酯纖維、尼龍和蛋白纖維等混紡織物建立一種新型的綠色酶法紡織品成分含量檢測技術(shù)。

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（作者單位：浙江省紡織測試研究院）endprint