張欣　貝盞臨　張安東

摘要：以寧夏海原香水梨（Pgrus ussuriensismaxim）為試材，研究采后在（20±0.5） ℃下果實(shí)中可溶性糖代謝及相關(guān)酶活性的變化特征。結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，香水梨果實(shí)中果糖含量前、中期不斷上升后期略微下降；葡萄糖含量先升后降；蔗糖含量逐漸降低，與之對(duì)應(yīng)的蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性均不斷降低，且SS活性均低于SPS。

關(guān)鍵詞：香水梨（Pgrus ussuriensismaxim）；可溶性糖；蔗糖合成酶；蔗糖磷酸合成酶

中圖分類(lèi)號(hào)：S661.2；TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6351-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.066

Abstract：The changes of soluble sugar metabolism and related enzyme activity in the fruit of Ningxia haiyuan Pgrus ussuriensismaxim after （20±0.5）℃ were studied. The results showed that with the storage time extension， fructose content rised in earlier and mid-term stage while declined slightly in later stage； glucose content first increased and then decreased； sucrose content decreased gradually， and the corresponding sucrose synthase （SS） and sucrose phosphatase （SPS） activity were gradually decreased and the activity of sucrose synthase were lower than that of sucrose phosphate synthase.

Key words：Pgrus ussuriensismaxim；soluble sugar；sucrose synthase；sucrose phosphate synthase

香水梨（Pgrus ussuriensismaxim）屬于波斯梨科果實(shí)，具有潤(rùn)肺清肺的功能，故深受大家的喜愛(ài)，而分布于甘肅、寧夏等地的香水梨可謂栽培歷史悠久[1]。香水梨具有極耐寒、抗旱性、耐澇性、抗鹽堿性，產(chǎn)果率高，容易豐收、穩(wěn)產(chǎn)，能夠適應(yīng)和抵抗各種自然災(zāi)害，是具有地方特色的優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)梨樹(shù)；其果實(shí)甜美，糖、維生素C、鐵、鋅等含量較高[2]，果實(shí)成熟時(shí)可立即食用，也可貯藏到冬季后食用，而且貯藏后的梨果色金黃，風(fēng)味更佳。這一貯藏過(guò)程被稱(chēng)為“出汗”，指的就是香水梨在秋冬貯藏季節(jié)內(nèi)受凍，然后又解凍，不斷反復(fù)多次以后，使果實(shí)內(nèi)成分發(fā)生變化，而香水梨的口味由采摘時(shí)的酸澀轉(zhuǎn)變?yōu)樘鹈揽煽?，這是發(fā)生了復(fù)雜的生理轉(zhuǎn)變過(guò)程。果實(shí)中糖含量的多少是影響果實(shí)口味的主要指標(biāo)之一，糖含量直接決定了果實(shí)品質(zhì)的優(yōu)劣，所以如何提高果實(shí)中糖類(lèi)含量已經(jīng)成為了提升梨果品質(zhì)的主要研究課題，然而對(duì)于如何提高果實(shí)中糖含量，首先要深入探討果實(shí)中糖代謝和累積變化規(guī)律，便于在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中采用相應(yīng)的對(duì)策來(lái)控制糖的定向積累[3]。目前對(duì)于香水梨中糖代謝的研究主要局限在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中[4]，而針對(duì)果實(shí)采后貯藏期內(nèi)糖代謝系統(tǒng)的研究卻鮮有報(bào)道。本研究以香水梨為試驗(yàn)材料對(duì)果實(shí)采后貯藏期內(nèi)糖代謝系統(tǒng)進(jìn)行初步研究，試圖發(fā)現(xiàn)果實(shí)貯藏期內(nèi)糖代謝系統(tǒng)變化規(guī)律，旨在對(duì)貯藏過(guò)程的香水梨中可溶性糖代謝系統(tǒng)進(jìn)行初步探索。本試驗(yàn)著重對(duì)香水梨在貯藏過(guò)程中果實(shí)內(nèi)糖代謝進(jìn)行有關(guān)研究：香水梨蔗糖、葡萄糖和果糖含量的動(dòng)態(tài)變化；香水梨蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）的動(dòng)態(tài)變化，為今后有關(guān)糖代謝的相關(guān)性研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香水梨于2014年10月采自寧夏海原縣果園中，選取具有良好品種特性、果實(shí)外表無(wú)明顯損傷、無(wú)病蟲(chóng)害、大小均一的果實(shí)，將果實(shí)保存于（20±0.5） ℃?zhèn)溆?，并分批抽樣進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試劑

尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG），6-磷酸-果糖（F6P），80%乙醇，NaOH，MgCl2，硫酸銨，蒽酮（AR），活性炭（AR），濃硫酸（AR），濃鹽酸（AR），果糖（AR），蔗糖（AR），葡萄糖（AR），間苯二酚，Tris，乙二醇，巰基乙醇，EDTA等生化試劑。

緩沖液A的配置：100 mmol/L Tris（pH 7.0），10 mmol/L MgCl2，2%乙二醇，20 mmol/L巰基乙醇，2 mmol/L EDTA。

緩沖液B的配置：20 mmol/L Tris（pH 7.0）， 10 mmol/L MgCl2，10%乙二醇，5 mmol/L巰基乙醇，2 mmol/L EDTA。

1.3 儀器

UV1000型紫外分光光度計(jì)（上海天美公司），JA5003B型電子天平和FA2104B型分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），ALPHA-1-2型真空冷凍干燥機(jī)（北京博勱行儀器有限公司），100 μL移液槍?zhuān)ㄉ虾＜寻卜治鰞x器有限公司），F(xiàn)R-1210型精密烘箱（天津市泰斯特儀器有限公司），TG16G型離心機(jī)和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海比朗儀器有限公司），冷凍離心機(jī)（Sigma公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 葡萄糖、蔗糖和果糖的提取及含量的測(cè)定 樣品中葡萄糖、蔗糖和果糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[5]?？扇苄蕴堑奶崛》椒▍⒖祭詈仙鶾6]的方法略加改動(dòng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6個(gè)25 mL的試管，編號(hào)，按表1配制不同溶度的可溶性糖（葡萄糖/果糖/蔗糖）標(biāo)準(zhǔn)液，精確吸取可溶性糖（葡萄糖/果糖/蔗糖）溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL于已標(biāo)記號(hào)的1、2、3、4、5、6號(hào)的試管中，依次加入1.00、0.90、0.80、0.70、0.60、0.50 mL 80%乙醇；在每只試管中加入4.0 mL蒽酮試劑，將各管搖勻，在沸水浴中保持10 min；取出后冷卻至室溫，于625 nm波長(zhǎng)處，用1號(hào)管調(diào)零，測(cè)定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)應(yīng)的吸光度。每組3次重復(fù)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中可溶性糖的測(cè)定：精確吸取上述1.0 mL還原性糖提取液，同樣加入4.0 mL蒽酮試劑充分混合，其余步驟同上。記錄各組數(shù)據(jù)，每組3次重復(fù)，用1號(hào)管調(diào)零于625 nm處測(cè)定吸光度，取平均值并計(jì)算出每克樣品中還原糖的含量。

1.4.2 蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性的測(cè)定 樣品的SS與SPS活性采用紫外分光光度法完成測(cè)定。

酶提取液的制備：酶液的制備與酶活力測(cè)定參文獻(xiàn)[7，8]的方法但略有改動(dòng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取0.60 mL不同質(zhì)量濃度（20～100 μg/mL）蔗糖溶液加入0.15 mL酶液充分混合均勻。在30 ℃水浴中保持10 min，取出后加入0.20 mL 2 mol/L NaOH，沸水中煮10 min，冷卻至室溫，依次加入2.8 mL 30% 鹽酸及0.8 mL 0.1%間苯二酚，搖勻，80 ℃水浴保溫10 min，取出冷卻至室溫，將酶液在480 nm處測(cè)定吸光度，繪制蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

SS活性的測(cè)定：在0.60 mL反應(yīng)體系中（含0.15 mL 200 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，0.15 mL 40 mmol/L MgCl2，0.15 mL 40 mmol/L果糖，0.15 mL 12 mmol/L UDPG），其余步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法相同[9]。

SPS活性的測(cè)定：在SS反應(yīng)體系中用40 mmol/L F-6-P取代40 mmol/L果糖，其余步驟與SS的測(cè)定方法相同。對(duì)于試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0進(jìn)行分析、計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差并制作相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間香水梨可溶性糖含量動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 由圖1可知，蔗糖、葡萄糖、果糖3種可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線符合測(cè)定要求，可用于對(duì)香水梨可溶性糖含量的測(cè)定。

2.1.2 貯藏期間香水梨果實(shí)中可溶性糖含量變化 由圖2可知，在整個(gè)采后貯藏期內(nèi)，香水梨果實(shí)中蔗糖含量不斷降低，整個(gè)下降趨勢(shì)都很明顯，并且一直低于葡萄糖、果糖的含量。由圖3可知，在采后20 d的貯藏期內(nèi)葡萄糖含量先上升后緩慢下降。在貯藏前中期，香水梨果實(shí)中葡萄糖含量不斷增加，到貯藏期14 d時(shí)達(dá)到最大值，隨著貯藏時(shí)間的推移，當(dāng)果實(shí)進(jìn)入貯藏后期，葡萄糖含量開(kāi)始下降。由圖4可知，在整個(gè)采后貯藏期內(nèi)香水梨果糖含量比較高，并且在隨后的貯藏前中期不斷上升，進(jìn)入后期后果糖含量開(kāi)始略微下降。在貯藏期開(kāi)始的時(shí)候，葡萄糖含量遠(yuǎn)低于同時(shí)期的果糖含量，大約為果糖的54%左右。另外在貯藏過(guò)程中香水梨果糖含量比較高，總體含量均高于葡萄糖和蔗糖之和。相對(duì)于葡萄糖和果糖，蔗糖在果實(shí)貯藏期間最低。貯藏期間內(nèi)各個(gè)時(shí)期果實(shí)中可溶性糖含量以果糖為主，其次為葡萄糖，蔗糖含量則最少。

2.2 貯藏期間香水梨SS、SPS活性動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 貯藏期間內(nèi)SS含量變化 由圖5可知，蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.004 3x-0.007 7，R2=0.997 1，符合測(cè)定要求，可用于對(duì)香水梨SS活性的測(cè)定。圖6為香水梨果實(shí)中SS活性隨貯藏期間的變化。在香水梨貯藏期間內(nèi)，果實(shí)中SS在貯藏初期酶活性最高，隨著貯藏時(shí)間的推移不斷降低，在貯藏后期SS活性的下降趨勢(shì)又明顯變緩。

2.2.2 貯藏期間香水梨SPS活性動(dòng)態(tài)變化 由圖7可知，蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.004 2x-0.008 4，R2=0.996 8，符合測(cè)定要求，可用于對(duì)香水梨SPS活性的測(cè)定。在香水梨貯藏期間內(nèi)，果實(shí)中SPS在貯藏初期酶活性都最高，隨著貯藏時(shí)間的推移不斷降低，在貯藏后期SPS活性的下降趨勢(shì)又明顯變緩。在整個(gè)貯藏期間SS均低于SPS。

2.3 相關(guān)性分析

由表2可知，蔗糖與葡萄糖呈極顯著負(fù)相關(guān)，蔗糖含量不斷減少，而葡萄糖含量不斷增加，蔗糖消耗的一部分有可能會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，且極有可能在貯藏期內(nèi)蔗糖主要轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。貯藏期間內(nèi)香水梨果實(shí)中蔗糖含量和SPS活性呈線性正相關(guān)，與SS活性也呈線性正相關(guān)，說(shuō)明貯藏期內(nèi)果實(shí)中蔗糖含量的逐漸下降和2種酶活性下降趨勢(shì)有著密切的關(guān)系，這與前人的研究相似[10]。

3 討論

糖類(lèi)是生物體內(nèi)的組分，它們本身就是細(xì)胞和生物體能量的主要來(lái)源，也是生物體許多重要性質(zhì)和功能不可缺少的基本元素[11]。糖類(lèi)在植物體內(nèi)不僅僅是光合作用的產(chǎn)物，又是呼吸作用的底物[12]，絕大部分光合產(chǎn)物主要以蔗糖等形式通過(guò)韌皮部運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)中，在果實(shí)發(fā)育的過(guò)程中經(jīng)過(guò)一系列酶代謝和跨膜運(yùn)輸，最后以部分蔗糖或者以果糖、葡萄糖、淀粉或其他糖類(lèi)形式累積在果實(shí)中，從而產(chǎn)生了不同口味的果實(shí)。在本試驗(yàn)果實(shí)采后貯藏過(guò)程中，香水梨果實(shí)中葡萄糖含量先上升后下降，蔗糖含量不斷減少。這可能是由于果實(shí)在貯藏過(guò)程初期，果實(shí)體內(nèi)參與分解蔗糖的酶活性比較高，連續(xù)分解蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而使葡萄糖含量上升，蔗糖含量下降；而在貯藏中后期，一是因?yàn)橄闼嬖谫A藏期間呼吸作用不停的消耗，再加上參與蔗糖代謝的相關(guān)酶活性由于貯藏溫度的原因開(kāi)始下降，導(dǎo)致了在貯藏中后期香水梨中葡萄糖和蔗糖含量都開(kāi)始下降。

在植物糖代謝過(guò)程中，SS通過(guò)催化蔗糖的分解與合成，保持蔗糖的濃度梯度，來(lái)控制果實(shí)中糖累積[13-15]。而SPS活性的高低決定了蔗糖在果實(shí)中含量的多少[16]。在果實(shí)貯藏過(guò)程中，香水梨果實(shí)內(nèi)蔗糖含量與相關(guān)蔗糖代謝酶活性在采后貯藏期內(nèi)變化一致，均呈線性正相關(guān)。這與Macrae等[17]對(duì)桃果實(shí)的研究發(fā)現(xiàn)一致，即隨著果實(shí)進(jìn)入成熟軟化期，果實(shí)內(nèi)淀粉水解，SPS活性上升，蔗糖含量開(kāi)始不斷增加，蔗糖積累和SPS活性的增加為線性正相關(guān)；Moriguchi等[18]對(duì)日本梨的研究也表明，SS、SPS 2種酶活性均在貯藏過(guò)程中表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。

果實(shí)糖代謝是一個(gè)非常復(fù)雜漫長(zhǎng)的歷程，果實(shí)成熟過(guò)程中糖類(lèi)的累積并非是由簡(jiǎn)單的一種酶在起作用，而是多種糖代謝相關(guān)酶的相互調(diào)節(jié)的結(jié)果。目前，對(duì)果實(shí)糖組分組成、細(xì)胞內(nèi)代謝相關(guān)酶的分布、果實(shí)成熟過(guò)程中糖含量和相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化等已有一定的認(rèn)識(shí)[15]。研究香水梨貯藏過(guò)程中可溶性糖及其相關(guān)酶活性的變化，可以為進(jìn)一步研究梨果實(shí)SS、SPS等糖代謝酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供參考。對(duì)今后果實(shí)中生態(tài)因子、內(nèi)源激素、糖信號(hào)的研究具有重要意義。

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