吳凡　李德臣　趙春曉　陳登松

摘要：概括了ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)的基本原理和特點(diǎn)，綜述了其在家蠶相關(guān)領(lǐng)域中應(yīng)用的研究進(jìn)展，并展望了其在家蠶遺傳研究上的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：家蠶；ISSR；遺傳研究；應(yīng)用

中圖分類(lèi)號(hào)：S881.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6124-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.004

Abstract： The basic principle and characteristics of Inter-simple Sequence Repeat （ISSR） was described. The application of ISSR in silkworm genetics was summarized. The application future in the study of silkworm was prospected.

Key words：silkworm；ISSR；genetics research； application

家蠶作為一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，成為研究遺傳、發(fā)育、生理、藥代動(dòng)力學(xué)等生物科學(xué)研究中理想的研究對(duì)象。常規(guī)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記在家蠶品種選育和鑒定等方面起到了一定的作用，但是很易受到內(nèi)外環(huán)境條件的影響。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，加錨微衛(wèi)星重復(fù)序列（Inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱(chēng)ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用于家蠶的遺傳多樣性分析、基因定位及系統(tǒng)分類(lèi)研究中。本文對(duì) ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)的基本原理和特點(diǎn)及其在家蠶相關(guān)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并展望了其在家蠶遺傳研究上的應(yīng)用前景，希望能對(duì)家蠶資源的研究及保存、鑒定和利用提供一定的參考。

1 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)基本原理和特點(diǎn)

1.1 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的基本原理

ISSR分子標(biāo)記方法是Zietkiewicz在微衛(wèi)星技術(shù)（Simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱(chēng)SSR）的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[1]，根據(jù)其所使用的引物是否在3′端或5′端加錨定堿基可以分為錨定簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增（Anchoredinter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱(chēng)ASSR）和非錨定簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增（Nonamchored inter-simple sequencerepeat，簡(jiǎn)稱(chēng)MP-PCR）。ASSR是在微衛(wèi)星寡核苷酸引物的3′端或5′端加上2～4個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸，引起特定位點(diǎn)退火，保證引物與基因組DNA中SSR的3′端或5′端結(jié)合[2]，擴(kuò)增重復(fù)序列間的片段。MP-PCR是直接以寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增重復(fù)片段和重復(fù)序列間的片段。擴(kuò)增出來(lái)的條帶可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，從而獲得指紋圖譜。

1.2 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)源于SSR分子標(biāo)記技術(shù)，因此具有SSR分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，可在基因組上進(jìn)行擴(kuò)增，可以快速、準(zhǔn)確和高效地檢測(cè)出位于基因組DNA上的多態(tài)性，適用物種范圍廣，可以揭示不同SSR座位個(gè)體間的變異信息，提供多位點(diǎn)信息[3-5]，成本較低， 重復(fù)性好， 操作簡(jiǎn)單，非常適合于對(duì)大樣本進(jìn)行檢測(cè)，而且該技術(shù)相比較于SSR技術(shù)，因?yàn)椴捎玫囊镄蛄斜容^長(zhǎng)，其遺傳多態(tài)性比較高，也同時(shí)提高了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在種群遺傳學(xué)、種質(zhì)資源、分類(lèi)學(xué)與種系發(fā)生學(xué)等方面得到迅速應(yīng)用[6-8]。

2 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在家蠶遺傳研究上的應(yīng)用

2.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性作為生物多樣性的一個(gè)重要組成部分，是種群繁殖和更新?lián)Q代的基礎(chǔ)，可反映出物種對(duì)不用環(huán)境的適應(yīng)能力，以及在環(huán)境的變化和變遷中所具有的持續(xù)計(jì)劃的潛力[9]。ISSR分子標(biāo)記能夠揭示物種基因組內(nèi)的多態(tài)性位點(diǎn)，是一種研究種群內(nèi)及種群間遺傳多樣性的理想方法之一[10]。

Li等[11]證明了ISSR分子標(biāo)記能夠運(yùn)用于家蠶遺傳多樣性分析，他們采用ISSR的方法，對(duì)42個(gè)家蠶品種進(jìn)行擴(kuò)增，有12條引物能擴(kuò)增出清晰條帶108條，其中多態(tài)性條帶85個(gè)，且重復(fù)性較好，通過(guò)聚類(lèi)分析，將這些品種分為7個(gè)亞群。房守敏等利用ISSR技術(shù)分析了6個(gè)家蠶品種和2個(gè)不同地域的野桑蠶群體的遺傳多樣性，6條ISSR引物共檢測(cè)到66個(gè)位點(diǎn)，其中65個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，并根據(jù)遺傳距離進(jìn)行了聚類(lèi)分析。Nagaraju等[12]采用ISSR技術(shù)對(duì)13個(gè)不同品種蠶的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析。Pan等[13]采用ISSR技術(shù)分析了9個(gè)家蠶細(xì)胞培養(yǎng)系的多態(tài)性，26條引物擴(kuò)增出797條多態(tài)性譜帶，多態(tài)率為89.9%。

2.2 資源鑒定及分類(lèi)

在對(duì)家蠶品種資源進(jìn)行鑒定和分類(lèi)時(shí)，由于其外部特征比較相像，中系一般為素蠶，日系一般為普斑蠶，雖然其大小有差異，但是僅僅根據(jù)其形態(tài)學(xué)，很難將其進(jìn)行區(qū)分和鑒定，但是其個(gè)體所攜帶的遺傳信息是不同的，因此可以根據(jù)其在基因組DNA上的多態(tài)性不同，將其準(zhǔn)確地分類(lèi)鑒定，ISSR 標(biāo)記技術(shù)在家蠶資源的鑒定和分類(lèi)中是非常有效的，可保證試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。

Reddy等[14]以6條ISSR引物對(duì)13個(gè)滯育和非滯育家蠶品系進(jìn)行了遺傳鑒定，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性占總數(shù)的77%。Velu等[15]采用ISSR分子標(biāo)記研究了20個(gè)家蠶突變體的遺傳變異關(guān)系，用15條引物擴(kuò)增出113個(gè)標(biāo)記，其中多態(tài)性的比率為73.45%，并進(jìn)行了聚類(lèi)分析，20個(gè)家蠶突變體可以分為6個(gè)類(lèi)群，結(jié)果表明該技術(shù)是確定突變的家蠶品系之間遺傳變異的一種重要方法。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

許多研究已表明，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在研究動(dòng)物種間、種群間的親緣關(guān)系以及動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育方面也取得了很好的效果。Chatterjee等[16]分別采用RFLP和ISSR等分子標(biāo)記的方法分析了家蠶遺傳學(xué)，比較了這兩種方法在家蠶遺傳學(xué)研究上的應(yīng)用，結(jié)果表明在指紋圖譜分析中，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)更具有優(yōu)勢(shì)。Pan等[17]成功建立了BmE-SWU1和BmE-SU2兩個(gè)家蠶細(xì)胞系，并獲得了兩個(gè)細(xì)胞系的ISSR指紋圖譜。endprint

2.4 家蠶分子標(biāo)記輔助選擇育種

家蠶分子標(biāo)記輔助選擇（Marker assisted selection，MAS）是利用了遺傳標(biāo)記與控制數(shù)量性狀的基因之間的連鎖關(guān)系，在實(shí)際選擇育種過(guò)程中，利用遺傳標(biāo)記和表型選擇相結(jié)合的方式來(lái)代替常規(guī)的育種方法，從而選育出具有優(yōu)良性狀的家蠶實(shí)用品種，已成為家蠶優(yōu)良品種選育過(guò)程中的重要方法，ISSR分析也可篩選出與優(yōu)良表型性狀基因緊密連鎖的DNA片段，使其成為一種能夠輔助育種的分子標(biāo)記[18]。

Srivastava等[19]用15對(duì)引物對(duì)15個(gè)多化性家蠶品種進(jìn)行ISSR-PCR分析，聚類(lèi)分析結(jié)果表明這15個(gè)品種分成5個(gè)類(lèi)群和1個(gè)隔離群，利用多重回歸分析發(fā)現(xiàn)其中的5條帶與熱處理后的化蛹率相關(guān)，相關(guān)性最大的是標(biāo)記8083000，該標(biāo)記可以用于以分子標(biāo)記輔助選擇熱耐受性家蠶品種的DNA標(biāo)記。Chatterjee等[16]也采用ISSR分子標(biāo)記的方法篩選了與家蠶發(fā)育及生產(chǎn)性狀相關(guān)標(biāo)記。Pradeep等[20]發(fā)現(xiàn)有ISSR標(biāo)記830.8（1 050 bp）與家蠶幼蟲(chóng)體重、全繭量、繭層量顯著相關(guān)，兩個(gè)ISSR標(biāo)記835.5（1 950 bp）和825.9（710 bp）與家蠶幼蟲(chóng)期顯著相關(guān)。

3 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在家蠶遺傳研究上的應(yīng)用前景

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)是一個(gè)非常成熟的分子標(biāo)記技術(shù)，它所需的設(shè)備技術(shù)簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，重復(fù)性強(qiáng)、多態(tài)性好等，對(duì)工作人員無(wú)危害。實(shí)踐證明，該技術(shù)在很多物種例如長(zhǎng)序榆[21]、玉米圓斑病菌[22]、石斛[23]、桑樹(shù)[24]等，在研究其遺傳多樣性、親緣關(guān)系、種質(zhì)資源的鑒定等方面都得到了廣泛的應(yīng)用，具有很好的適應(yīng)性。

家蠶作為一種模式生物和重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，目前在家蠶研究中應(yīng)用較多的分子標(biāo)記是AFLP、SSR和RAPD，但是有關(guān)ISSR應(yīng)用于家蠶研究的報(bào)道還不多。隨著家蠶基因序測(cè)序的完整和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，很多SSR標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)和利用，ISSR標(biāo)記是在SSR標(biāo)記的技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的，使用的引物可以是SSR引物，也可以是加錨的SSR引物，人們應(yīng)該積極地拓寬該技術(shù)在家蠶遺傳研究上應(yīng)用的深度，特別是在家蠶種質(zhì)資源的鑒定、遺傳多樣性、親緣關(guān)系的分析、抗性育種等方面，積極借鑒在其他動(dòng)物上成功應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)等，促進(jìn)家蠶遺傳育種的研究進(jìn)展，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將在家蠶新組合的早期鑒定中起到非常重要的作用，同時(shí)可以縮短育種年限、提高育種工作效率，促進(jìn)家蠶品種的更新?lián)Q代。

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