張靖國　田瑞　陳啟亮　楊曉平　范凈　胡紅菊

摘要：砂梨[Pyrus pyrifolia （Burm. f.）Nakai]一般為二倍體植物，染色體基數(shù)為17，從分布在砂梨17條不同的染色體上的60對簡單序列重復標記（Simple sequence repeats，SSR）引物中篩選出分別位于17條染色體的17對多態(tài)性引物對97份砂梨核心種質(zhì)進行擴增，共檢測到等位基因276個，每對引物檢測到的等位基因數(shù)在8～26個，平均為16.4個，表明所選引物具有較高的鑒別力。多態(tài)信息含量指數(shù)（PIC）變幅為0.670（CH03d12）～0.926（CH03d02），平均為0.817，顯示出較高的多態(tài)性信息，表明砂梨核心種質(zhì)蘊含有極為豐富的遺傳多樣性，具有極高的代表性。試驗建立起一套基于SSR分子標記的引物組合與鑒定體系標準，通過反映不同染色體上的遺傳信息，在同一平臺上可以同時將數(shù)百份甚至上千份的品種資源區(qū)分開來，這對梨科研、教學及生產(chǎn)中的資源收集保存、品種鑒別、品種權保護具有十分重要的意義。

關鍵詞：砂梨[Pyrus pyrifolia （Burm. f.）Nakai]；核心種質(zhì)；簡單序列重復標記；指紋圖譜

中圖分類號：S661.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6284-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.048

Abstract： 17 primer pairs with clear polymorphic bands were selected from 60 pairs of Simple sequence repeats （SSR） locus that covering 17 linkage groups of Pyrus pyrifolia （Burm. f.） Nakai genetic map， and were then amplified in 97 varieties of P. pyrifolia core collection. A total of 276 polymorphic bands were obtained with 8 to 26 bands per primer locus （averaging 16.4 bands）. The polymerphism information content （PIC） of the 17 SSR loci ranged from 0.670 to 0.926 with an average of 0.817， which show abundant genetic polymorphism in P. pyrifolia core collections. Results from these standard sets of SSRs are presented and can be used to facilitate comparison of data sets from different germplasm collections to detect duplicates and synonyms.

Key words：Pyrus pyrifolia （Burm. f.）Nakai； core collections； simple sequence repeats； fingerprint

關于種質(zhì)資源的指紋圖譜或分子身份證構建是當前資源鑒定評價研究的熱點之一。國際植物品種權保護聯(lián)盟（UPOV）已將DNA分子標記鑒定納入農(nóng)作物品種DUS（Distinctness，uniformity，stability）測試內(nèi)容，并在BMT測試指南草案中將構建 DNA 指紋數(shù)據(jù)庫的標記方法確定為簡單序列重復標記（Simple sequence repeats，SSR）和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。而SSR標記因具有多態(tài)性高、重復性好、共顯性遺傳和易于檢測等優(yōu)點，已被 UPOV 生物化學和分子技術工作組驗證為植物新品種保護最廣泛應用的標記體系[1]。SSR分子標記已經(jīng)被廣泛用于包括果樹在內(nèi)的各種作物指紋圖譜構建研究。然而，一個普遍存在的問題是由于不同的資源保存單位所保存的相同種質(zhì)資源常常由于彼此研究所使用的鑒定體系或引物組合不同而難以相互比較，這使得其資源圃中存在的同物異名、同名異物等問題的種質(zhì)難以得到準確鑒定和發(fā)現(xiàn)，這給種質(zhì)資源的利用帶來一定風險。因此，建立一套標準的SSR引物組合和鑒定方法將會有助于解決這一難題。

國家果樹種質(zhì)武昌砂梨圃多年來一直致力于砂梨[Pyrus pyrifolia（Burm. f.）Nakai]種質(zhì)資源的收集保存、鑒定評價、提供利用等工作。目前共收集保存砂梨資源800余份，并已經(jīng)開展核心種質(zhì)構建工作[2]。試驗擬建立一套基于SSR分子標記的引物組合和鑒定體系標準，并將砂梨核心種質(zhì)的參考指紋圖譜作為種質(zhì)資源保護的依據(jù)，同時也為不同研究單位的砂梨種質(zhì)鑒定等研究提供方便。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試材為砂梨核心種質(zhì)97份，均采自國家果樹種質(zhì)武昌砂梨圃。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用改良CTAB法提取梨葉片基因組DNA。所提DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度法定量后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物篩選 為了使構建的分子身份證能夠盡量全面的反映梨全基因組所有染色體遺傳信息，參照Terakami等[3]和Celton等[4]構建的梨遺傳連鎖圖，選擇分布于梨17個連鎖群的60對多態(tài)性SSR引物用于篩選，引物序列參照Yamamoto等[5]、Liebhard等[6]的報道。正向引物5′端加了一個FAM的熒光標記。所有引物由北京鼎國生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增及產(chǎn)物檢測 PCR反應體系包括10×PCR buffer（含Mg2+）5 μL，Taq酶（2U/μL）1 μL，dNTPs （10 mmol/L） 1 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，DNA模板（50 ng/μL）1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應在Gene Amp PCR System 9 600（Perkin Elmer，USA）上進行。PCR反應程序為94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，48～56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共35個循環(huán)；72 ℃、10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)過ABI3730X Genetic Analyzer （Applied Biosystems，USA）分離，采用ROX500作為分子量分析內(nèi)標，通過GeneMapper v 4.0 軟件分析得到不同樣品擴增片段的長度。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 SSR位點的多態(tài)性信息含量指數(shù)（Polymorphism information content，PIC）的計算公式為PIC=1-ΣPi2，式中Pi表示第i個等位位點出現(xiàn)的頻率。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選

通過對60對SSR引物進行擴增檢測，最終確定多態(tài)性高、擴增產(chǎn)物清晰且分別位于17條染色體上的17對SSR引物用于指紋圖譜構建，這17對SSR引物的基本信息見表1。

2.2 引物等位基因信息分析

分析表1可知，17對引物在97份試材中共檢測到等位基因276個，每對引物檢測到的等位基因數(shù)在8（CH03d12）～26（CH04e05和CH03d02）個，平均為16.4個。引物位點的PIC變幅為0.670（CH03d12）～0.926（CH03d02），平均為0.817，顯示出較高的多態(tài)性信息，表明砂梨核心種質(zhì)蘊含有極為豐富的遺傳多樣性，同時也表明所篩選的17個SSR位點具有較高的鑒別力。

2.3 砂梨核心種質(zhì)指紋圖譜構建

利用篩選出的17對SSR引物對97份砂梨核心種質(zhì)進行擴增，獲得了不同材料在不同位點的等位基因片段大小，具體見表2和圖1。例如木瓜梨在位于LG1的NH013a位點的擴增片段大小為200 bp和204 bp，香蕉梨在NH013a、CH03d12、CH01h10、NH017a、NH004a 5個位點經(jīng)過反復多次驗證均沒有擴增產(chǎn)物，表明該品種可能在這5個位點發(fā)生重組或出現(xiàn)了變異。

3 討論

SSR引物是遺傳連鎖圖構建的理想標記，而目前多數(shù)主要作物的遺傳連鎖圖譜已經(jīng)完成。因此在進行指紋圖譜研究時，可以考慮利用遺傳連鎖圖譜中揭示的遺傳信息。如陳昌文等[7]參照桃遺傳連鎖圖上的SSR位點信息，每條染色體選擇2個SSR位點，共篩選出16個SSR位點用于中國桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構建。梨目前已經(jīng)有較為飽和的遺傳連鎖圖[3，4]，大量的SSR位點已經(jīng)定位于對應于染色體的遺傳連鎖群上。因此試驗從已經(jīng)定位梨遺傳連鎖圖譜上的SSR位點可以進行篩選，最終確定分布于17個連鎖群的17個SSR位點可以進行指紋圖譜構建，以期能夠反映不同染色體上的遺傳信息。此外，試驗選定的17對SSR引物中的8對引物（以CH開頭）由蘋果中開發(fā)得到[6]，其在梨分子身份證構建中的成功應用，表明蘋果與梨基因組具有較高的相似性。

SSR擴增產(chǎn)物的檢測方法主要有兩種，分別是銀染技術和熒光標記分析技術。郝晨陽等[8]在小麥上詳細地分析比較了常規(guī)的SSR熒光標記分析技術和銀染技術，認為熒光標記分析技術具有更高的靈敏性、更經(jīng)濟、數(shù)據(jù)收集和處理效率高、數(shù)據(jù)更準確等優(yōu)點。高源等[9]利用SSR熒光檢測技術用于梨的遺傳多樣性研究，取得了經(jīng)濟、靈敏、高效的結果。本研究結果也表明，SSR熒光檢測技術較傳統(tǒng)的銀染技術（試驗前期研究曾采用過）在擴增條帶大小判讀識別上明顯具有準確性好、效率高等優(yōu)點。

指紋圖譜構建不僅是保護品種資源知識產(chǎn)權、維護生產(chǎn)者和育種家利益的需要，對梨種質(zhì)資源的管理和利用也具有重要意義。通過本研究，建立起一套基于SSR分子標記的引物組合和鑒定體系標準，并構建了砂梨核心種質(zhì)的指紋圖譜，通過反映不同染色體上的遺傳信息，在同一平臺上可以同時將數(shù)百份甚至上千份的品種資源區(qū)分開來，這對于梨科研、教學及生產(chǎn)中的資源收集保存、品種鑒別、品種權保護等都具有十分重要的意義。

參考文獻：

[1] 滕海濤，呂 波，趙久然，等.利用DNA指紋圖譜輔助植物新品種保護的可能性[J].生物技術通報，2009（1）：1-4.

[2] 張靖國，胡紅菊，田 瑞，等.中國砂梨初級核心種質(zhì)的構建[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（8）：1590-1592.

[3] TERAKAMI S，KIMURA T，NISHITANI C，et al. Genetic linkage map of the Japanese pear Housui identifying three homozygous genomic regions[J]. J Japan Soc Hort Sci，2009，78（4）： 417-424.

[4] CELTON J M，CHAGN D，TUSTIN S D，et al. Update on comparative genome mapping between Malus and Pyrus[J].BMC Research Notes，2009，2：182.

[5] YAMAMOTO T， KIMURA T， SHODA M，et al. Development of microsatellite markers in the Japanese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）[J]. Molecular Ecology Notes，2002，2：14-16.

[6] LIEBHARD R，GIANFRANCESCHI L，KOLLER B，et al. Development and characterisation of 140 new microsatellites in apple （Malus× domestica Borkh.）[J]. Molecular Breeding，2002，10： 217-214.

[7] 陳昌文，曹 珂，王力榮，等.中國桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構建[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44（10）：2081-2093.

[8] 郝晨陽，王蘭芬，賈繼增，等.SSR熒光標記和銀染技術的比較分析[J].作物學報，2005，31（2）：144-149.

[9] 高 源，田路明，劉鳳之，等.TP-M13-SSR技術在梨遺傳多樣性研究中的應用[J].果樹學報，2011，28（3）：394-399.