Cx43基因轉(zhuǎn)染對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

徐雅會(huì)1，王德華2

(1靜?？h醫(yī)院，天津301600；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

摘要：目的 觀察縫隙連接蛋白43(Cx43)基因修飾對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。方法SKOV3細(xì)胞分為觀察組、對(duì)照組和空白組，觀察組和對(duì)照組分別用重組表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-Cx43、空載質(zhì)粒pBudCE4.1轉(zhuǎn)染，空白組不做任何處理。分別采用RT-PCR法、Western blot法檢測(cè)各組Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)，采用劃痕荷載染料傳輸實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞間通訊功能，采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期的變化，采用CCK-8法、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分別觀察細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的變化。結(jié)果與對(duì)照組和空白組相比，觀察組Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高，細(xì)胞傳遞的熒光強(qiáng)度明顯增高，細(xì)胞周期處于G0/G1期數(shù)目較多，S期的細(xì)胞數(shù)目明顯降低；細(xì)胞增殖降低，遷移和侵襲能力均明顯下降，P均<0.05。結(jié)論 Cx43可抑制SKOV3細(xì)胞的增殖和遷移，可作為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：卵巢癌；SKOV3細(xì)胞；縫隙連接蛋白43；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.011

中圖分類號(hào)：R737.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-05-08)

卵巢惡性腫瘤是常見的女性惡性腫瘤[1]，手術(shù)及放化療均可提高治療有效率，但5年生存率仍較低[2]。腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移是導(dǎo)致卵巢癌患者死亡的主要因素。因此，深入探討與卵巢癌增殖和遷移相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)對(duì)于卵巢癌的治療和預(yù)防有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白43(Cx43)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，Cx43的表達(dá)異?？赡芘c腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖有關(guān)[3]。2013年7月～2015年2月，我們觀察了重組質(zhì)粒pBudCE4.1Cx43轉(zhuǎn)染人卵巢癌SKOV3細(xì)胞對(duì)其增殖及遷移的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料SKOV3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM購(gòu)自北京天跟生物有限公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000TM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，L-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司，重組真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-Cx43及空載質(zhì)粒pBudCE4.1購(gòu)自杭州吉諾生物公司，RNA提取試劑TRIzol、G418、DNA凝膠純化回收試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，EDTA購(gòu)自天津市化學(xué)試劑一廠，DNA marker、RT-PCR兩步法試劑盒購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，羅氏黃液購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，cDNA合成試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司，PCR 引物序列由Invitrogen 公司化學(xué)合成，Western blot蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州博日公司，CCK-8購(gòu)自上海炎彬化工公司，兔抗人Cx43多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、鼠抗GAPDH 單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG購(gòu)自美國(guó)KPL公司，PVDF膜、Matrigel膠、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

1.2細(xì)胞分組及干預(yù)采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化后傳代，2～3 d換液1次后備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，2×105/孔。將細(xì)胞分為觀察組、對(duì)照組、空白組，每組3個(gè)復(fù)孔。觀察組待細(xì)胞融合80%左右時(shí)，采用Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-Cx43載體，操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pBudCE4.1，空白組不做任何處理。三組干預(yù)后培養(yǎng)48 h后備用。

1.3SKOV3細(xì)胞Cx43 mRNA檢測(cè)采用RT-PCR法。取各組細(xì)胞，PBS洗滌3遍，通過TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴(kuò)增Cx43和內(nèi)參GAPDH。Cx43上游引物：5′-GTCGACATGGGTGAC-TGGAGCGCCTT-3′，下游：5′-GCGGCCGCCTAGATC-TCCAGGTCATCAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為149 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照，GAPDH上游引物：5′-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3′，下游：5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為185 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，共30個(gè)循環(huán)(內(nèi)參28個(gè)循環(huán))后，72 ℃延伸30 s。將PCR的產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳在100 V、90 min條件下進(jìn)行鑒定，應(yīng)用紫外分析儀器觀察電泳結(jié)果并照相，之后在讀膠儀(Gel Doe 2000)上進(jìn)行掃描，采用Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶的灰度值，用Cx43/GAPDH代表Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.4SKOV3細(xì)胞中Cx43 蛋白檢測(cè)采用Western blot法。取各組細(xì)胞，每組1×107個(gè)，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)10%的SDS-PAGE 進(jìn)行分離，最后用電轉(zhuǎn)移法至PVDF的膜上，以5%脫脂奶粉在37 ℃下密封1 h。加入1∶1 000稀釋的Cx43多克隆一抗，4 ℃孵育24 h，加入1∶5 000 HRP標(biāo)記的二抗和GAPDH，室溫孵育45 min，在暗室曝光X線片后經(jīng)膠片沖洗，采用UVI 的凝膠成像系統(tǒng)給予攝像，按Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶的灰度值，以Cx43/GAPDH代表Cx43的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.5SKOV3細(xì)胞間通訊功能觀察采用劃痕荷載染料傳輸實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞分別接種至培養(yǎng)液中，待細(xì)胞融合率100%時(shí)，置于0.05%的羅氏黃液里，用手術(shù)刀片在玻片上輕柔劃線數(shù)條，浸泡細(xì)胞3 min，洗去染料，PBS沖洗3次，加入少許PBS浸潤(rùn)細(xì)胞，將玻片置于熒光顯微鏡下，隨機(jī)取10個(gè)區(qū)域拍照，OLMPUS光學(xué)顯微鏡下觀察,以Imagepro5.1圖像分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，然后取其平均值，以作為熒光的相對(duì)強(qiáng)度值。

1.6SKOV3細(xì)胞周期檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。取各組細(xì)胞，4 ℃、70 %的冷乙醇沉淀細(xì)胞后將其混勻備用。洗滌細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，加入含50 μg/mL RNA 酶的Tris-HCL緩沖液(pH 7.4)后培養(yǎng)30 min。100 μg/mL碘化丙啶染色后置于暗室1 h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，取平均值。

1.7SKOV3細(xì)胞增殖能力觀察采用CCK-8法。取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到96孔板中，將細(xì)胞密度調(diào)整至2×103/孔，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后加入10 μL/孔CCK8，以不加細(xì)胞的空白孔為對(duì)照組，應(yīng)用酶標(biāo)儀分析培養(yǎng)48、72、120 h時(shí)450 nm處的光密度(OD)值。

1.8細(xì)胞遷移能力觀察采用細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，按5×103/孔接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，置于10%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞鋪滿約80%孔板，采用無(wú)血清的DMEM進(jìn)行輕柔漂洗，用10 L的液槍于垂直培養(yǎng)板上劃“一”字劃痕，DMEM清洗細(xì)胞3次，棄劃痕處細(xì)胞，每孔加入2 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡(100倍)下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.9SKOV3細(xì)胞侵襲能力觀察采用小室侵襲實(shí)驗(yàn)。各取三組細(xì)胞懸液100 μL，細(xì)胞總數(shù)3×105/L，置于含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，刮掉濾膜上室的未穿過細(xì)胞，95%乙醇固定5 min，PBS輕柔漂洗3次，蘇木精染色10 min后再次PBS沖洗小室，自然涼干后，取上室聚碳酸酯濾膜沿邊緣固定在膜內(nèi)面朝上玻片上，封片；200×光鏡下于記數(shù)左、右、上、下、中5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1三組Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)比較見表1。

表1　三組Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05；與空白組比較，▲P<0.05。

2.2三組細(xì)胞通訊功能比較 觀察組、對(duì)照組、空白組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別為1.86±0.09、0.93±0.12、1.10±0.07，與對(duì)照組及空白組相比，觀察組熒光強(qiáng)度增高，P均<0.05。

2.3三組細(xì)胞周期比較 見表2。

表2　三組細(xì)胞周期比較

注：與空白組、對(duì)照組同期比較，*P<0.05。

2.4 三組細(xì)胞增殖能力比較見表3。

表3　三組細(xì)胞OD值比較

注：與空白組、對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.5三組細(xì)胞遷移能力比較48 h后觀察組細(xì)胞劃痕愈合緩慢，而對(duì)照組和空白組細(xì)胞劃痕已基本長(zhǎng)滿。

2.6三組細(xì)胞體外侵襲能力比較觀察組、對(duì)照組、空白組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(28.59±3.65)、(65.45±3.76)、(66.32±3.81)個(gè)，P均<0.01。

3討論

卵巢癌起病隱匿，目前尚缺乏有效的早期診療手段。近年來(lái)，基因治療已成為卵巢癌治療的新途徑[4]。卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展不僅與SKOV3細(xì)胞的分化異常、增殖過度有關(guān)，而且與細(xì)胞遷移、侵襲有關(guān)[5～7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多項(xiàng)抗卵巢癌的藥物都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制性可能是影響化療效果的關(guān)鍵因素[8.9]。Cx43是新發(fā)現(xiàn)的一類非突變型的抑癌基因，普遍存在于細(xì)胞間的直接通道，可調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號(hào)傳遞，氨基酸、離子、核苷酸、第二信使及分子量<1 000 Da的代謝分子均能通過Cx43調(diào)控在細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)傳遞[10，11]。Cx43可充當(dāng)為一個(gè)參與物質(zhì)變換的重要通道，其形成、開啟和關(guān)閉均受到多種因素調(diào)節(jié)。以往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞間縫隙連接較少，連接蛋白的表達(dá)水平均低于正常細(xì)胞[12,13]。多種腫瘤細(xì)胞中均出現(xiàn)Cx43基因表達(dá)的下降或缺失，并伴有細(xì)胞間縫隙連接通訊的阻斷[14，15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與其余兩組相比，觀察組Cx43的 mRNA、蛋白的表達(dá)水平升高，細(xì)胞間通訊功能明顯加強(qiáng)，細(xì)胞周期處于G0/G1期數(shù)目較多，S期的細(xì)胞數(shù)目明顯降低；細(xì)胞增殖能力降低，遷移和侵襲能力均明顯下降，提示Cx43可增強(qiáng)細(xì)胞間隙連接通訊，降低細(xì)胞生長(zhǎng)速度，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，有望成為未來(lái)卵巢癌基因治療的新靶點(diǎn)。

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