·論著·

炎性因子對人胰腺癌PaTu8988細胞NF-κB及Hedgehog通路成員表達的影響

王玉瓊丁佳寅諸嫻吳紅玉金晶滿曉華高軍李兆申

【摘要】目的探討腫瘤壞死因子 α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)對人胰腺癌PaTu8988細胞核因子κB(NF-κB)及Hedgehog(HH)通路成員Shh、SMO、Gli1、SuFu基因表達的影響。方法分別應用TNF-α和IL-1β刺激人胰腺癌PaTu8988細胞48 h，以未處理細胞作為對照組。采用實時定量RT-PCR和蛋白質印跡法檢測各組細胞NF-κB及Shh、SMO、Gli1、SuFu的mRNA和蛋白表達，采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡。結果TNF-α刺激組、IL-1β刺激組、對照組PaTu8988細胞的NF-κB mRNA表達量分別為9.92±0.78、7.74±0.32、1.01±0.08；Gli1 mRNA為7.25±0.45、5.74±0.33、1.00±0.06；Shh mRNA為3.60±0.36、4.33±0.45、1.00±0.04；SMO mRNA為1.03±0.15、1.07±0.16、1.01±0.06；SuFu mRNA為0.88±0.14、0.96±0.13、1.01±0.05。其中TNF-α刺激組、IL-1β刺激組的NF-κB、Gli1、Shh mRNA表達量均較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P值<0.05或<0.01)。兩刺激組的NF-κB、Gli1、Shh蛋白表達量也較對照組增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。TNF-α刺激組、IL-1β刺激組、對照組PaTu8988細胞凋亡率分別為(17.40±2.87)%、(11.05±1.34)%、(49.90±2.96)%，TNF-α刺激組、IL-1β刺激組的細胞凋亡率均較對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)。結論TNF-α和IL-1β可激活PaTu8988細胞的NF-κB和HH信號通路的Shh、Gli1基因的表達，減少細胞的凋亡。

【關鍵詞】胰腺腫瘤;Hedgehog蛋白質類；信號傳導；炎癥;NF-κB

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.01.005

基金項目：國家自然科學基金(81272663，30910103911)；國家科技支撐計劃(2006BAI02A12)；上海市重點科技攻關項目(11441901800)

收稿日期：(2014-08-21)

Pro-inflammatory cytokines inhibit apoptosis of pancreatic ductal adenocarcinoma cells via both NF-κB and Hedgehog signaling pathwaysWangYuqiong,Dingjiayin,ZhuXian,WuHongyu,JinJing,ManXiaohua,GaoJun,LiZhaoshen.DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai210043,China

Correspondingauthor:GaoJun,Email:gaojunaaa@gmail.com;LiZhaoshen,Email:zhsli@81890.net

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of TNF-α and IL-1β on the expression of human pancreatic cancer PaTu8988 NF-κB and Hedgehog (HH) signaling pathways members Gli1, Shh, SMO, SuFu. MethodsPancreatic cancer cell line PaTu8988 was treated with TNF-α and IL-1β, respectively, for 48 h, and cells without treatment were control group. Then the protein and mRNA expression of NF-κB and Shh, SMO, Gli1, SuFu was determined by RT-PCR and Western blot; apoptosis of cells were tested by flow cytometry. ResultsThe expressions of NF-κB mRNA in PaTu8988 cells in TNF-α group, IL-1β group, control group were 9.92±0.78, 7.74±0.32, 1.01±0.08; and the expressions of Gli1 mRNA were 7.25±0.45, 5.74±0.33, 1.00±0.06; and the expressions of Shh mRNA were 3.60±0.36, 4.33±0.45, 1.00±0.04; and the expressions of SMO mRNA were 1.03±0.15, 1.07±0.16, 1.01±0.06; and the expressions of SuFu mRNA were 0.88±0.14, 0.96±0.13, 1.01±0.05. The expressions of NF-κB, Gli1,

作者單位：210043第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內科(王玉瓊、諸嫻、丁佳寅、吳紅玉、金晶、滿曉華、高軍、李兆申)；解放軍411醫(yī)院分院內科(王玉瓊)

通信作者：高軍，Email：gaojunaaa@gmail.com;李兆申，Email：zhsli@81890.net

Shh mRNA in TNF-α group, IL-1β group were significantly higher than that in control group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The expressions of corresponding proteins were consistent with the expressions of mRNA. The apoptosis rates in TNF-α group, IL-1β group, control group were (17.40±2.87)%, (11.05±1.34)%, (49.90±2.96)%, and the apoptosis rates in TNF-α group, IL-1β group were significantly lower than that in control group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.01). ConclusionsTNF-α and IL-1β can activate the expression of NF-κB and Shh, Gli1 in human pancreatic cancer PaTu898, and decrease apoptosis.

【Key words】Pancreatic neoplasms;Hedgehog proteins;Signal transduction;Inflammation;NF-kappa B

流行病學研究發(fā)現(xiàn)，高達15%的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與感染引起的炎癥相關[1-2]。轉錄因子NF-κB是炎癥因子中的重要成員，正常情況下與inhibitor kappa B(IκB)結合處于無活性狀態(tài)，炎癥時IκB激酶(IκB kinase, IKK)復合物可被腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)等激活，通過泛素-蛋白酶途徑降解，從而釋放出NF-κB，從胞質轉移到胞核內，進而調控下游基因表達[3-4]。研究證實，NF-κB參與胰腺癌的發(fā)生[5-6]。Hedgehog(HH)信號通路在胚胎發(fā)育及胰腺癌等腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。HH信號通路主要由配體sonic hedgehog(Shh)、跨膜蛋白受體smoothened (SMO)、核轉錄因子glioma-associated oncogene (Glis)和抑制因子suppressor of fused(SuFu)等組成。一些信號通路也可通過影響SuFu、SMO而活化HH通路[7]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，在彌漫性大B細胞淋巴瘤中，HH信號通路和NF-κB共同異常增多[7]。為此，本研究應用TNF-α、IL-1β刺激胰腺癌細胞株PaTu8988，檢測細胞受刺激后NF-κB及HH信號通路成員表達及細胞凋亡的變化，探討其作用機制。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)及分組

胰腺癌細胞株PaTu8988由上海長海醫(yī)院消化內科實驗室保存。常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞，以5×105個細胞密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，共接種3皿，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素各10 U/ml)置37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細胞貼壁后換含1% FBS的DMEM培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素各10 U/ml)“饑餓”12 h，分別以10 ng/ml的人重組TNF-α、5 ng/ml的人重組IL-1β刺激PaTu8988細胞48 h，收集細胞。以未處理的細胞作為對照組。人重組TNF-α及IL-1β均購自B&D公司。

二、蛋白質印跡法檢測蛋白表達

按蛋白提取試劑盒(Thermo公司)說明書分別提取細胞胞質蛋白及胞核蛋白，以二喹啉甲酸法測蛋白濃度。取待測樣本30 μg上樣，常規(guī)行蛋白質印跡法檢測Shh、SMO、Gli1、SuFu、NF-κB蛋白表達，分別以Histone、GAPDH為內參。一抗的工作濃度分別為1∶3 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶200、1∶2 000、1∶2 000，二抗工作濃度1∶5 000，最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。通過凝膠成像系統(tǒng)掃描各條帶的灰度值。以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。

三、實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測mRNA表達

收集各組PaTu8988細胞，采用Trizol(Takara公司)抽提細胞總RNA。先逆轉錄成cDNA，再行PCR反應。Shh、SMO、Gli1、NF-κB、SuFu、Histone、GAPDH探針均購自Life Technology公司。實時PCR反應程序：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60℃ 1 min，40個循環(huán)。以公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

四、流式細胞儀檢測細胞凋亡

Annexin V/FITC 試劑盒購自eBioscience公司，按說明書操作。收集刺激48 h的各組PaTu8988細胞，PBS沖洗3次后以200 μl Binding buffer重懸，加入3 μl Annexin V，暗室放置15 min，加6 μl碘化丙啶，混合后上流式細胞儀(美天妮公司產(chǎn)品)檢測細胞凋亡。結果用flowjo軟件分析。實驗重復3次，取均值。

五、統(tǒng)計學處理

結果

一、TNF-α、IL-1β刺激后PaTu8988細胞Gli1、NF-κB mRNA及蛋白表達變化

TNF-α刺激組、IL-1β刺激組、對照組PaTu8988細胞的NF-κB mRNA表達量分別為9.92±0.78、7.74±0.32、1.01±0.08，蛋白表達量分別為1.00±0.01、0.98±0.03、0.79±0.04，TNF-α、IL-1β刺激組的表達均較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為19.19、30.11、14.55、11.44，P值均<0.05，圖1)。TNF-α刺激組、IL-1β刺激組、對照組PaTu8988細胞的Gli1 mRNA表達量分別7.25±0.45、5.74±0.33、1.00±0.06，蛋白表達量分別為0.96±0.05、0.93±0.04、0.70±0.04，TNF-α、IL-1β刺激組的表達均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為25.11、22.07、5.51、7.22，P值均<0.05，圖1)。

圖1　對照組(1)、TNF-α刺激組(2)、IL-1β刺激組(3)PaTu8988細胞胞核內Gli1、NF-κB蛋白表達

二、TNF-α、IL-1β刺激后PaTu8988細胞Shh、SMO、SuFu mRNA及蛋白表達變化

TNF-α刺激組、IL-1β刺激組、對照組PaTu8988細胞Shh mRNA的表達量分別為3.60±0.36、4.33±0.45、1.00±0.04，蛋白表達量為0.85±0.05、0.75±0.06、0.60±0.04，兩刺激組的表達均較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為13.35、13.88、45.08、6.99，P<0.05或<0.01，圖2)。TNF-α刺激組、IL-1β刺激組、對照組PaTu8988細胞SMO mRNA的表達量分別為1.03±0.15、1.07±0.16、1.01±0.06，蛋白表達量為0.73±0.04、0.70±0.02、0.72±0.01；SuFu mRNA的表達量分別為0.88±0.14、0.96±0.13、1.01±0.05，蛋白表達量為0.72±0.01、0.74±0.05、0.73±0.00，兩刺激組與對照組的差異均無統(tǒng)計學意義(t值分別為0.16、0.57、0.63、2.61、1.52、0.63、0.82、0.32，P值均>0.05，圖2)。

三、TNF-α、IL-1β 刺激后PaTu8988細胞凋亡變化

TNF-α刺激組、IL-1β刺激組、對照組PaTu8988細胞凋亡率分別為(17.40±2.87)%、(11.05±1.34)%、(49.90±2.96)%(圖3)。TNF-α、IL-1β刺激組的細胞凋亡均較對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為19.98、29.97，P值均<0.01)。

圖2　對照組(1)、TNF-α刺激組(2)、IL-1β刺激組(3)PaTu8988細胞胞質內Shh、SMO、SuFu蛋白的表達

圖3對照組(3A)、TNF-α刺激組(3B)、IL-1β刺激組(3C)PaTu8988細胞的凋亡圖

討論

在對彌漫性大B細胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，NF-κB可激活HH通路，上調SMO的表達[7]。另有研究[8-14]報道，包括EGF/EGFR、Wnt/β-鏈蛋白、TGF-β1、TGF-β R在內的多個信號通路可影響正常細胞和腫瘤細胞SuFu的作用而調控Glis的表達和(或)穩(wěn)定性，導致HH通路活化，促進HH靶基因表達。

胰腺癌發(fā)病過程極為復雜，有多種信號系統(tǒng)參與。NF-κB和HH信號通路是其中的兩個重要系統(tǒng)，它們的相互作用越來越受到學者的關注。Nakashima等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β等通過激活NF-кB誘導Shh過度表達，激活HH信號通路，且NF-κB p65與Shh在胰腺癌組織中的表達呈顯著正相關，阻斷NF-κB可以抑制Shh mRNA的表達。

本研究結果顯示，TNF-α、IL-1β刺激胰腺癌PaTu8988細胞后，NF-κB表達上調，同時HH通路的Shh、Gli1基因表達也上調，而SMO及SuFu表達量無變化，提示炎癥因子的刺激可同時激活NF-κB與HH通路，兩條通路存在一定的相關性，NF-κB可能通過Gli1入核增多而激活HH通路。本研究結果還顯示，炎癥因子刺激可抑制PaTu8988細胞的凋亡。

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(本文編輯：屠振興)