晏華春，馬曉燕，劉艷芳，依明·蘇來曼（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

PCR方法擴(kuò)增種屬特異性片段檢測(cè)牛羊肉成分

晏華春，馬曉燕，劉艷芳，依明·蘇來曼
（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

為建立市場(chǎng)上各種熟肉制品成分的檢測(cè)方法，利用PCR方法比對(duì)牛、雞、羊、豬的DNA基因組序列，確定了針對(duì)4種常見肉類的特異性檢測(cè)引物。結(jié)果表明：獲得的引物具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，建立的PCR檢測(cè)方法樣品用量少、結(jié)果準(zhǔn)確，適合應(yīng)用于特異性檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增；特異性檢測(cè)；模板DNA；熟肉制品

新疆是多民族聚住的地區(qū)，各民族的飲食方式和習(xí)慣有所不同。本研究的目的是建立各種熟肉制品成分的檢測(cè)方法，為廣大人民的飲食需求提供某種程度上的理論知識(shí)。

在市場(chǎng)中，消費(fèi)者經(jīng)常會(huì)遇到以雞肉冒充豬肉、以豬肉冒充牛羊肉等、用低價(jià)劣質(zhì)的肉冒充高價(jià)優(yōu)質(zhì)肉的欺騙行為，這些單位或個(gè)人為追求自身利益而極大地?fù)p害了消費(fèi)者的利益和健康［1］。目前，質(zhì)監(jiān)部門主要通過傳統(tǒng)的鑒別方法，對(duì)肉制品的味道、色澤、肉類的紋理等進(jìn)行肉類來源判別，對(duì)市場(chǎng)上假冒生肉的鑒別起到了非常重要的作用［2］。然而，對(duì)于很多熟肉制品（如香腸）來說，運(yùn)用傳統(tǒng)的方法卻無法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。因?yàn)槭烊庵破芳尤氲娜饨?jīng)過了粉碎處理，并且添加香料及其他調(diào)料，掩蓋了原有的味道，質(zhì)量難以鑒定。因此，國(guó)家及地方各級(jí)質(zhì)監(jiān)部門急需建立一種分析食品中肉類來源的快速、有效的檢測(cè)方法。

蛋白質(zhì)鑒定和分子遺傳學(xué)鑒定是目前肉制品品種鑒定的兩個(gè)主要方法，其中分子遺傳學(xué)鑒定方法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，主要的原因是DNA比蛋白質(zhì)的耐熱性強(qiáng)，高溫處理過的食品中仍能提取出小片段DNA，而多數(shù)蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性，無法滿足鑒定需要。分子遺傳學(xué)鑒定方法可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的目的基因進(jìn)行研究，不依賴于組織和細(xì)胞的類型，不同的基因片段進(jìn)化效率不同，DNA比蛋白質(zhì)具有更高的種間多態(tài)性，有利于品種鑒定［3］。在食品加工過程中，部分DNA不會(huì)被破壞，所以利用PCR法可以不受肉類高溫加工的影響。另外，PCR法能夠簡(jiǎn)便快速地完成檢測(cè)，且成本較低，也易于快速推廣［4］。國(guó)內(nèi)陳穎等［5］在檢測(cè)保健品中牛羊源性成分的過程中使用了PCR方法，所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)牛成分檢測(cè)低限為0.05%，甚至可以擴(kuò)增含有0.005%的山羊成分的樣品。楊寶華等［6-7］應(yīng)用線粒體DNA的特異性建立分析飼料中蛋白牛羊來源的PCR方法，通過不同肉類來源的線粒體基因比對(duì)，確定針對(duì)豬、牛、羊、雞線粒體基因的特異性引物。應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)熟肉制品的肉類來源檢測(cè)具有取樣少，所選引物特異性強(qiáng)，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)［8］。通過對(duì)市場(chǎng)上的一些熟肉制品的隨機(jī)檢測(cè)，結(jié)果表明大多數(shù)正規(guī)廠家的熟肉制品的肉類來源基本可靠。以PCR為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)方法具有很高的靈敏度和特異性，這些方法先后應(yīng)用于肉制品的種屬鑒定中，為食品監(jiān)管部門判定肉制品摻假造假提供了技術(shù)支持，其中一些方法有較強(qiáng)的實(shí)用性，已經(jīng)或可能作為肉制品鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。基因芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)能實(shí)現(xiàn)從混合物中快速、定量檢測(cè)物種成分，將成為肉制品種屬鑒定的主要發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，PCRMix，MARKER，1.5%瓊脂糖，2%瓊脂糖，10×TBE，T10E10，T10E1，USSTE裂解液，70%的乙醇，10%SDS，生理鹽水，Tris.Cl，0.5mol/L的EDTA，50×TAE，電泳上樣緩沖液，等等。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

移液器，超凈工作臺(tái)，低溫離心機(jī)，圓周振蕩器，凝膠成像儀，微型離心機(jī)，PCR儀，瓊脂糖水平電泳槽，電泳儀，電冰箱，微波爐。

1.3 待檢測(cè)樣品

在引物特異性驗(yàn)證過程中，用到的檢測(cè)樣品有市場(chǎng)上肉類制品，如牛肉、雞肉、羊肉、豬肉、火腿腸、雞肉腸、牛肉腸等。

1.4 PCR引物的確定

結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)果，通過分析和比對(duì)常見肉類的mtDNA的保守序列，確定了針對(duì)不同動(dòng)物線粒體DNA的特定片段，自己分別設(shè)計(jì)出了不同種屬動(dòng)物引物，見表1。

表1 不同種屬動(dòng)物的引物

1.5 方法

1.5.1 羊肉DNA的提取方法 ①取15～20mg樣品放入離心管內(nèi)加800μLUSSTE裂解懸浮，用眼科剪刀盡量剪碎組織。②加15μL蛋白酶K，55℃水浴震蕩12～15 h，直至無組織塊。③每管加等體積飽和酚800μL搖勻10min，低溫10 000 r/min離心10min。④取上清液600μL加500μL飽和酚和500μL氯仿異戊醇（24∶1），搖勻10min，10 000 r/min離心10min。⑤取上清液400μL加等體積氯仿異戊醇（24∶1），搖勻10min，10000 r/min離心10min。⑥取上清液200μL加等體積氯仿異戊醇（24∶1），搖勻10min，10 000 r/min離心10min。⑦取上清液100μL加兩倍體積冷無水乙醇，搖勻5min，置于-20℃冷凍30min，然后12 000 r/min離心10min。⑧棄去上清，加500μL 70%的乙醇浸洗2次（除雜質(zhì)）。⑨棄去上清，自然干燥30min。⑩待乙醇晾干后加50μL T10E1，37℃溶解沉淀，貯存4℃或-20℃。

1.5.2 火腿腸、雞肉腸、牛肉腸等的DNA提取方法 ①取15～20mg樣品放入離心管內(nèi)加400μLUSSTE裂解懸浮，200μLT10E10，70℃溫浴10min。②加等體積氯仿異戊醇（24∶1），搖勻10min，10 000 r/min離心5min。③取上清液，加等體積冷無水乙醇，搖勻5min，置于-20℃冷凍10min，然后10 000 r/min離心5min。④棄去上清，加500μL 70%的乙醇浸洗2次（除雜質(zhì)）。⑤棄去上清，自然干燥30min。⑥待乙醇晾干后加50μL T10E1，37℃溶解沉淀，貯存4℃或-20℃。

1.5.3 PCR檢測(cè) 將設(shè)計(jì)好的引物分別與提取到的生羊肉、熟豬肉、熟牛肉、熟雞肉DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。具體方法如下：以牛肉DNA與牛引物的反應(yīng)為例。取牛DNA等量加入100μL無菌PCR管中，加入牛引物（正向和反向引物均相等）。在每個(gè)PCR管中加入適量含Tap DNA酶、dNTPs等的2×master，然后再加入無菌雙蒸水稀釋。將反應(yīng)體系放入PCR儀中，設(shè)定不同的變性、退火和延伸時(shí)間和溫度。一般反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)如表2所示。

表2 PCR檢測(cè)方法的循環(huán)參數(shù)

根據(jù)引物、模板及反應(yīng)體系的不同在具體PCR過程中，循環(huán)參數(shù)會(huì)有輕微的波動(dòng)。反應(yīng)完畢后將PCR產(chǎn)物取出，利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性檢測(cè)

建立用PCR方法檢測(cè)熟肉制品中肉類來源的方法，需要對(duì)合成的引物進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)其是否可以通過PCR擴(kuò)增獲得目標(biāo)條帶，同時(shí)也需要分析引物的特異性和靈敏度，檢測(cè)其能否滿足檢測(cè)的需要。提取牛、雞、羊、豬的DNA，分別用牛、雞、羊、豬的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1～4所示。

圖1擴(kuò)增結(jié)果表明：牛引物與牛DNA可發(fā)生PCR擴(kuò)增，雞DNA與雞引物可發(fā)生PCR擴(kuò)增，羊DNA與羊引物可發(fā)生PCR擴(kuò)增，豬DNA與豬引物可發(fā)生PCR擴(kuò)增。

圖1 D-LOOP方法檢測(cè)牛、雞、羊、豬DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2擴(kuò)增結(jié)果表明：牛引物與牛DNA可發(fā)生PCR擴(kuò)增，雞DNA與雞引物可發(fā)生PCR擴(kuò)增，羊DNA與羊引物可發(fā)生PCR擴(kuò)增，豬DNA與豬引物可發(fā)生PCR擴(kuò)增。

圖2 CytB方法檢測(cè)牛、雞、羊、豬DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 隨機(jī)檢測(cè)市場(chǎng)熟肉制品的結(jié)果

圖3擴(kuò)增結(jié)果表明：雞DNA與雞引物可發(fā)生PCR擴(kuò)增；豬DNA與豬引物可發(fā)生PCR擴(kuò)增。

圖3 D-LOOP方法檢測(cè)未知物DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4擴(kuò)增結(jié)果表明：雞DNA和雞引物可以發(fā)生擴(kuò)增；豬DNA和豬引物可以發(fā)生擴(kuò)增。

圖4 CytB方法檢測(cè)未知物DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的牛、雞、羊和豬引物只有在同源DNA為模板的情況下能夠發(fā)生PCR擴(kuò)增，而不能與非同源DNA發(fā)生反應(yīng)，表明各引物都具有良好的種屬特異性。應(yīng)用PCR方法檢測(cè)熟肉制品的特異性好。本實(shí)驗(yàn)對(duì)正規(guī)超市中的9種熟肉制品，用合成的特異引物進(jìn)行了PCR檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果證實(shí)了9種熟肉制品中的肉類來源與標(biāo)簽中的注明相符，說明此方法可以對(duì)熟肉制品進(jìn)行鑒定。2001年，Lahiff等［9］建立了檢測(cè)飼料中綿羊、豬和雞成分的DNA方法，用于反芻動(dòng)物成分的檢測(cè)，并且在此基礎(chǔ)上建立了定量PCR分析方法。Tajima K等采用分散重復(fù)序列（SINE）設(shè)計(jì)了牛、綿羊和山羊的擴(kuò)增引物，該引物對(duì)以上3種動(dòng)物成分的檢測(cè)靈敏度達(dá)0.01%［10］。Tanabe S等采用定量PCR的方法分析食物中豬、雞、牛、羊及馬肉來源，并且可以實(shí)現(xiàn)較為準(zhǔn)確的定量。本實(shí)驗(yàn)采用了上述研究同樣的方法初步檢測(cè)出了牛肉、雞肉、羊肉及豬肉等的含量成分，結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

本研究通過比對(duì)牛、雞、羊、豬的線粒體基因組序列，確定了針對(duì)4種常見肉類的特異性檢測(cè)引物。實(shí)驗(yàn)證明，獲得的引物具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，建立的PCR檢測(cè)方法樣品用量少，結(jié)果準(zhǔn)確，適合應(yīng)用于特異性檢測(cè)。

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Q75

A

2095-3887（2015）04-0017-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.005

2015-04-28

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310758002）

晏華春（1988-），男，碩士研究生。

依明·蘇來曼（1971-），男，維吾爾族，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：動(dòng)物遺傳育種。