不同程度間歇性低氧大鼠學(xué)習(xí)記憶及皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化

趙雅寧王紅陽(yáng)1李琳1馬素慧

(河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000)

摘要〔〕目的復(fù)制不同程度間歇性低氧動(dòng)物模型，觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化，探討阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)導(dǎo)致認(rèn)知障礙的機(jī)制。方法60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(n=20)、輕度間歇低氧組(n=20)、重度間歇低氧組(n=20)。對(duì)照組暴露于空氣中，間歇低氧組分別暴露于不同低氧條件下(100 ml/L和50 ml/L，暴露時(shí)間每天8 h，持續(xù)時(shí)間2、4、6、8 w)。Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶功能，光鏡和電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。結(jié)果與對(duì)照組比較，隨低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，兩間歇性低氧組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷； TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多(P<0.05)；水迷宮檢測(cè)動(dòng)物逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)；上述變化在重度間歇性低氧組最為顯著(P<0.05)；輕度間歇性低氧組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞6 w達(dá)高峰，組內(nèi)各時(shí)間差異顯著(P<0.05)；重度間歇性低氧組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞8 w達(dá)高峰，組內(nèi)各時(shí)間差異顯著(P<0.05)。結(jié)論間歇性低氧可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，且認(rèn)知損傷程度和神經(jīng)細(xì)胞凋亡與間歇性低氧的時(shí)間和程度有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕低氧；凋亡；認(rèn)知障礙

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R563.3〔

基金項(xiàng)目：河北省科技廳資助項(xiàng)目(No.09276103D-11)

通訊作者：王紅陽(yáng)(1957-)，女，教授，主要從事呼吸病學(xué)研究。

1河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院

第一作者：趙雅寧(1974-)，女，副教授，博士，主要從事呼吸病學(xué)研究。

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS) 患者睡眠時(shí)反復(fù)出現(xiàn)不同程度的低氧血癥和(或)高碳酸血癥，最終引起全身多系統(tǒng)、多器官的漸進(jìn)性損害。臨床資料顯示OSAHS可造成患者警覺(jué)、執(zhí)行能力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)方面的認(rèn)知障礙〔1，2〕。皮質(zhì)和海馬是腦內(nèi)與認(rèn)知和記憶等高級(jí)功能密切相關(guān)的重要部位，其結(jié)構(gòu)的損傷可造成智力下降及認(rèn)知行為紊亂。本研究中，我們?cè)趨⒖计渌麑W(xué)者慢性間歇性缺氧模型基礎(chǔ)上，利用實(shí)時(shí)氧監(jiān)測(cè)的反饋信號(hào)模擬臨床呼吸暫停事件的真實(shí)狀態(tài)，研究不同間歇性低氧狀態(tài)對(duì)腦組織形態(tài)變化、神經(jīng)細(xì)胞凋亡特點(diǎn)以及認(rèn)知功能的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器雄性SD大鼠60只〔北京維通利華公司，合格證SCXK(京)2002-003〕，體重310～350 g；TUNEL試劑盒購(gòu)自中杉生物有限公司(北京)。H-7650透射電鏡(日本日立公司)；Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所)；測(cè)氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；低氧控制程序(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科)；純氮(天津六方氣體高科技有限公司)；低氧艙(天津醫(yī)科大學(xué)研制)。

1.2動(dòng)物分組和模型制備60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(n=20)、輕度間歇低氧組(暴露低氧條件100 ml/L，n=20)和重度間歇低氧組(暴露低氧條件50 ml/L，n=20)。間歇低氧組每天8：00 am～4：00 pm將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于模型艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)夂涂諝?，每次循環(huán)2 min，連續(xù)給予氮?dú)?0 s，分別維持艙內(nèi)氧濃度最低至10%、7.5%和5%(100、75、50 ml/L)，隨后均復(fù)氧至氧濃度21%。對(duì)照組持續(xù)充入壓縮空氣。用數(shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)艙內(nèi)氧濃度變化，使艙內(nèi)氧濃度維持在各自的氧濃度內(nèi)，使其氧濃度波動(dòng)范圍在±0.5%以?xún)?nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取出，送入常規(guī)飼養(yǎng)箱內(nèi)自由飲水與攝食，生活環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。各組每天實(shí)驗(yàn)8 h,實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為2、4、6和8 w。對(duì)照組暴露于正?？諝庵校环謩e在實(shí)驗(yàn)第2、4、6和8周進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試和所設(shè)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察各組各時(shí)間點(diǎn)4只動(dòng)物，在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)以戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg),用40 g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定后取腦,后固定24 h，梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋，切片,片厚5 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇降至水，HE染色。每只鼠連續(xù)3張冠狀背側(cè)海馬切片，采用圖像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)計(jì)數(shù)正常神經(jīng)元，取均值。電鏡標(biāo)本制備：動(dòng)物常規(guī)麻醉，開(kāi)胸、暴露心臟，混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸緩沖液)心臟灌流，斷頭取腦，取大腦海馬組織，切成1 mm ×1 mm ×1 mm 組織塊，立即以40 ml/L戊二醛固定，0.1 mol/L 二甲砷酸緩沖液沖洗兩遍，再經(jīng)40 ml/L四氧化鋨固定,緩沖液沖洗,逐級(jí)丙酮脫水,環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋、超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡(日立H-7650)80 kV下觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.4原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL法)標(biāo)本多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，按TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。陽(yáng)性率的定量分析：每個(gè)標(biāo)本取 4張切片，每張切片在海馬隨機(jī)選取 4 個(gè)視野，在 200 倍光鏡下應(yīng)用目鏡網(wǎng)格測(cè)試系統(tǒng)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，取均值。

1.5學(xué)習(xí)和記憶功能檢測(cè)采用Morris水迷宮進(jìn)行檢測(cè)。每只動(dòng)物晨起訓(xùn)練5次后分別在上午、下午各測(cè)試6次，分別記錄各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間單位為(s)；及撤去平臺(tái)后動(dòng)物穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)，取檢測(cè)記錄的總均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)比較進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1病理結(jié)果光鏡：對(duì)照組皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本結(jié)構(gòu)正常，排列整齊致密，偶見(jiàn)變性壞死的神經(jīng)元；輕中重度間歇性低氧組中，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷改變，表現(xiàn)為細(xì)胞變性水腫和死亡形態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞。與對(duì)照組比較，兩組間歇低氧組皮質(zhì)和海馬區(qū)存活神經(jīng)元密度隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)明顯減少(P<0.05)；輕度低氧組存活神經(jīng)元密度6 w最低，而重度低氧組8 w最低(P<0.05，表1)。電鏡：對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞核規(guī)則，核仁清晰，核質(zhì)均勻散在，核膜光滑，邊緣清晰，神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器,包括高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、多聚核糖體、線粒體、溶酶體等豐富，結(jié)構(gòu)正常；突觸結(jié)構(gòu)完整清晰。間歇低氧組隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)和低氧程度加重神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化出現(xiàn)核仁消失，胞質(zhì)中的電子密度減低區(qū)增多，胞質(zhì)空泡化，細(xì)胞器減少、突觸小泡模糊、數(shù)量減少甚至不能辨認(rèn)。見(jiàn)圖1。

2.2海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化TUNEL陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞核。對(duì)照組大鼠海馬區(qū)只有極少數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，間歇性低氧組中陽(yáng)性細(xì)胞呈集中分布，主要分布皮質(zhì)和海馬區(qū)，尤其是前額葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)、齒狀回、杏仁核區(qū)域最為突出。與對(duì)照組比較，輕度和重度間歇性低氧組中皮質(zhì)和海馬區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)均不同程度增加；輕度間歇性低氧TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量6 w達(dá)高峰，8 w表達(dá)減少；重度間歇低氧組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量8 w達(dá)高峰，組內(nèi)各時(shí)間比較差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2，圖2。

2.3學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)估與對(duì)照組比較，輕度和重度間歇性低氧組大鼠逃避潛伏期時(shí)間均延長(zhǎng)、穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)均減少；與輕度組比較，重度間歇性低氧組逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)減少(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1　皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)存活神經(jīng)元密度比較 ± s， n=20)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與本組內(nèi)前一時(shí)點(diǎn)比較：2)P<0.05，表2同

圖1　各組大鼠6 w海馬區(qū)神經(jīng)元和突觸結(jié)構(gòu)變化(電鏡，×20 000)

組別皮質(zhì)區(qū)2w 4w 6w 8w海馬區(qū)2w 4w 6w 8w對(duì)照組1.98±0.362.14±0.322.08±0.502.00±0.482.40±0.422.42±0.382.58±0.572.74±0.56輕度組3.12±0.581)2)4.89±0.681)2)8.96±1.451)2)5.96±0.781)2)3.40±0.491)2)4.39±0.731)2)9.54±1.361)2)6.10±0.721)2)重度組7.10±0.841)9.60±0.921)2)13.96±3.001)2)18.70±2.561)2)6.60±0.691)9.68±0.791)2)15.94±2.921)2)19.82±2.611)2)

表3　各組大鼠逃避潛伏期及穿臺(tái)次數(shù)的比較 ± s， n=20)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與輕度組比較：2)P<0.05

圖2　重度間歇低氧6 w組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū) 凋亡神經(jīng)細(xì)胞(×400)

3討論

學(xué)習(xí)是人和動(dòng)物依賴(lài)于經(jīng)驗(yàn)來(lái)改變自身行為以適應(yīng)環(huán)境的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程，而記憶是將學(xué)習(xí)到的信息貯存和“讀出”的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程，兩者相互聯(lián)系。水迷宮測(cè)試中逃避潛伏期反映大鼠通過(guò)對(duì)空間標(biāo)志物的比較和評(píng)價(jià)來(lái)尋找平臺(tái)位置的能力，即獲取有效學(xué)習(xí)能力，而檢測(cè)穿越原平臺(tái)位置次數(shù)反映記憶的保持能力，結(jié)果顯示隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)和缺氧程度越重，動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶損傷越嚴(yán)重，這不但與低壓損害學(xué)習(xí)記憶具有“高度依賴(lài)形式”的報(bào)道相一致，同時(shí)與臨床實(shí)際相符合〔3〕。皮質(zhì)和海馬是腦內(nèi)與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的部位。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明損毀雙側(cè)海馬可大大妨礙動(dòng)物視覺(jué)分辨學(xué)習(xí)，使大鼠Y宮分辨學(xué)習(xí)和防御條件反應(yīng)的保持遭到嚴(yán)重的破壞〔4〕；與生活環(huán)境簡(jiǎn)單大鼠比較，生活在復(fù)雜環(huán)境的動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)增多，其大腦皮層發(fā)達(dá)，突觸聯(lián)系增多〔5〕。臨床上，神經(jīng)影像學(xué)顯示OSAHS患者大腦的多個(gè)部位和功能區(qū)受損如大腦皮質(zhì)灰質(zhì)丟失，海馬區(qū)在內(nèi)的腦實(shí)質(zhì)萎縮等〔6〕。本研究提示間歇性低氧可直接造成海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，且與低氧程度相關(guān)，再次證明低氧造成的認(rèn)知障礙與皮質(zhì)和海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)的損傷有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。但病理狀態(tài)下，神經(jīng)細(xì)胞凋亡異常增多是多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病諸如腦卒中、老年癡呆和帕金森等疾病的重要病理機(jī)制〔7，8〕。我們前期的研究顯示不同的干預(yù)方法抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡可明顯改善腦損傷后的神經(jīng)功能障礙〔9，10〕。本研究提示間歇性低氧造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與低氧程度有關(guān)，輕度間歇性低氧組凋亡細(xì)胞數(shù)量與低氧時(shí)間的延長(zhǎng)不是完全平行的，凋亡細(xì)胞數(shù)量在6 w達(dá)高峰，而重度間歇性低氧組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量呈高度時(shí)間依賴(lài)式增多，8 w達(dá)高峰，分析其原因可能是輕度慢性缺氧誘導(dǎo)了低氧耐受，啟動(dòng)了大腦內(nèi)部某些內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，而重度低氧直接導(dǎo)致了神經(jīng)損傷。在分布區(qū)域方面，凋亡神經(jīng)細(xì)胞呈集中分布，主要分布皮質(zhì)和海馬區(qū)，尤其是前額葉皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)、齒狀回、杏仁核區(qū)域最為突出；此與腦缺血主要造成海馬CA1區(qū)及紋狀體區(qū)神經(jīng)元凋亡不同〔11〕。有學(xué)者〔12〕認(rèn)為間斷低氧類(lèi)似于缺血再灌注，可造成神經(jīng)元的丟失，且缺氧較缺血對(duì)腦細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用更加明顯。本研究中間歇性低氧的特征反復(fù)發(fā)生的低氧/再?gòu)?fù)氧為特征，氧化應(yīng)激是其神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素，這可能是低氧與缺血造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡不同的原因之一。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了不同程度間歇性低氧導(dǎo)致皮質(zhì)和海馬區(qū)腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，神經(jīng)元丟失，這在一定程度上解釋了OSAHS患者認(rèn)知功能損害的原因。

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〔2012-11-13修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)