斑蝥酸鈉維生素B6對人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 的增殖抑制作用

關(guān)永紅祁盛昆1劉賢英

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長春130041)

摘要〔〕目的觀察斑蝥酸鈉維生素B6對體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3細(xì)胞)的增殖抑制率、凋亡率及其對細(xì)胞周期的影響。方法應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6對SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率。流式細(xì)胞儀定量檢測經(jīng)斑蝥酸鈉維生素B6作用后的SKOV3細(xì)胞周期進(jìn)程的變化及凋亡率。結(jié)果不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多，SKOV3細(xì)胞凋亡率升高。結(jié)論斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細(xì)胞生長增殖有顯著的抑制作用,抑制SKOV3細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而使S期細(xì)胞減少，造成G2/M期細(xì)胞相對增多，誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕SKOV3細(xì)胞；斑蝥酸鈉；細(xì)胞周期；凋亡

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：劉賢英(1966-)，女，副主任護(hù)師，主要從事婦科腫瘤研究。

1吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院2012級

第一作者：關(guān)永紅(1966-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

卵巢癌是因早期缺乏特異性的診斷指標(biāo)，當(dāng)患者出現(xiàn)癥狀和體征時(shí)往往已進(jìn)展到晚期。因此，尋求卵巢癌治療的有效藥物具有重要意義。斑蝥酸鈉系斑蝥的主要抗腫瘤活性成分——斑蝥素的半合成衍生物〔1〕，用于中晚期肝癌、胃癌、腎癌及宮頸癌等治療，獲得較為滿意的結(jié)果。本研究應(yīng)用人卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)為靶點(diǎn)，體外觀察不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞周期進(jìn)程的變化，旨在為人卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料SKOV3細(xì)胞株購于上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞庫，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT試劑)RPMI1640培養(yǎng)基購于美國sigma公司，斑蝥酸鈉維生素B6注射液10 ml/支，內(nèi)含斑蝥酸鈉0.1 mg，維生素B6 25 mg，貴州柏強(qiáng)制藥有限公司生產(chǎn)，胎牛血清購自長春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，100 μl/孔靜止培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%匯合時(shí)，按加入斑蝥酸鈉濃度分為0 μg/ml組(對照組)、1.0 μg/ml組、20 μg/ml組、4.0 μg/ml及8.0 μg/ml，每個(gè)濃度10復(fù)孔，置37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)24 h，結(jié)束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，棄去上清，每孔內(nèi)加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩5 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解。應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 nm處測定各孔吸光度A值，計(jì)算SKOV3細(xì)胞增殖抑制率，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。SKOV3細(xì)胞抑制率=(1-加藥孔細(xì)胞A值÷對照孔細(xì)胞A值)×100%。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進(jìn)行。每個(gè)濃度3瓶，培養(yǎng)結(jié)束后用0.25%胰白蛋白酶消化，收集細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70% 冷乙醇固定，4℃內(nèi)保存。上機(jī)前過40目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106/ml,PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果以Moidff2.0軟件分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MTT結(jié)果不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6對SKOV3細(xì)胞增殖均有影響，且呈劑量依賴性，與對照組相比差異顯著(P<0.01)；其中對照組A值1.36；1 μg/ml組A值1.24，抑制率8.9%；2 μg/ml組A值1.11，抑制率18.4%；4 μg/ml組分別為0.89，34.6%；8 μg/ml組為0.82，39.7%。

2.2流式細(xì)胞儀結(jié)果不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3 細(xì)胞周期進(jìn)程均有影響，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多，細(xì)胞凋亡率升高，組間比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1　不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細(xì)胞

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已認(rèn)識到惡性腫瘤的本質(zhì)在于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控，使本來應(yīng)脫離細(xì)胞周期而停止增殖或應(yīng)自行凋亡的細(xì)胞不斷地進(jìn)入細(xì)胞周期，從而出現(xiàn)無限制、自主的細(xì)胞增殖和分裂，最終導(dǎo)致腫瘤〔2〕。 斑蝥酸鈉維生素B6是一種廣譜的抗癌新藥〔3〕，是斑蝥素的衍生物，他保持了斑蝥素特有的抗癌活性，而毒副作用比斑蝥素小，其抗癌機(jī)制是抑制腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，降低腫瘤細(xì)胞CAMP的活性，抑制腫瘤DNA、RNA及前體的滲入，從而使腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變〔4〕。

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細(xì)胞周期各時(shí)相進(jìn)程均有影響。細(xì)胞周期是由G1、S、G2/M期所組成的一個(gè)復(fù)雜過程，其進(jìn)程受各種細(xì)胞因子的嚴(yán)格控制，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)失控即可發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，斑蝥酸鈉維生素B6制劑可阻滯SKOV3細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化進(jìn)程，G1期細(xì)胞堆積，不能進(jìn)入S期，造成G1期細(xì)胞增多，G1期細(xì)胞是制造和產(chǎn)生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白體，而且G1期糖原合成最為顯著。同時(shí)G1期也是化學(xué)藥物作用的敏感點(diǎn)〔5〕，因此，抑制細(xì)胞G1期的RNA合成，從而使腫瘤細(xì)胞增殖變緩。本研究結(jié)果顯示由于G1期細(xì)胞堆積，造成S期細(xì)胞減少，從而使G2/M期細(xì)胞相對增多。G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反映〔6〕,這一點(diǎn)從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞凋亡率上得到了體現(xiàn)。

綜上所述，斑蝥酸鈉維生素B6作為抗癌藥物，不僅能直接抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖。也可通過抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的變化，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)，且隨著藥物濃度增加和時(shí)間的延長抑制作用明顯，呈時(shí)間一劑量依賴關(guān)系，但斑蝥酸鈉的抗腫瘤的機(jī)制是多方面的，有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1劉展華，曹洋，陳銳深，等.斑蝥酸鈉對人肺癌LAC細(xì)胞增殖的抑制作用〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2008；19(1)：32-3.

2趙珍珍,李俊,王維剛,等.不同癌細(xì)胞系對斑蝥酸鈉的藥物敏感性檢測〔J〕.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013;34(4)：10-5.

3劉忠虎,陳艾江,馬新剛,等.斑蝥酸鈉維生素B6注射液輔以胸腔鏡內(nèi)臟神經(jīng)切斷術(shù)治療癌腹痛〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2013;40(5)：398-9.

4Murthy SC,Mason DP，Raja S，etal. Malignant pleural effusion:one size does not fit all〔J〕.Ann Thorac Surg,2013;96(4):1525-6.

5Brted J,Ludas J.Mammalian G1and S-phase checkpoints in reponse to DNA damage 〔J〕.J Curr Opin Cell Biol,2001;13(6):734-47.

6Eillnger Ziegelbauer H,Karasuyama H,Yamada E,etal.Ste20-like kinase(SLK),a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells,2000;5(6):491-8.

〔2014-05-17修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)