柴胡皂苷A對抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的保護作用

董海影張靜艷柏青楊王紹清張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學院病理學系，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討柴胡皂苷A對抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的保護作用及機制。方法60只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、西藥組、中藥組；采用慢性不可預見性應激刺激結合孤養(yǎng)方式建立抑郁模型；利用敞箱實驗與糖水偏愛度檢測大鼠行為學改變；采用電鏡觀察大鼠腦海馬區(qū)超微結構變化；應用免疫組化與RT-PCR檢測大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)蛋白及基因的表達水平。結果與正常對照組相比，模型組水平運動得分、垂直運動得分和糖水偏愛度明顯降低(P<0.01，P<0.001)，與模型組比較，西藥組和中藥組水平運動得分、垂直運動得分和糖水偏愛度均明顯升高(P<0.05，P<0.001)；與正常對照組相比，模型組大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA與蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)，與模型組相比，西藥組、中藥組海馬區(qū)BDNF mRNA與蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)。結論柴胡皂苷A抗抑郁癥的作用機制可能與其促進海馬區(qū)BDNF蛋白與mRNA的活性和表達，進而減少神經(jīng)細胞凋亡有關。

關鍵詞〔〕柴胡皂苷A；抑郁癥；腦源性神經(jīng)生長因子；細胞凋亡

中圖分類號〔〕R749.4〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12521624)

通訊作者：張曉杰(1965-)，女，教授，碩士生導師，博士，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學研究。

第一作者：董海影(1982-)，女，講師，碩士，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學研究。

世界衛(wèi)生組織(WHO)最新統(tǒng)計抑郁癥全球患病率約11%，并預測2020年抑郁癥將成為全球第二位醫(yī)療疾患〔1〕?，F(xiàn)有抗抑郁癥藥主要包括單胺氧化酶抑制劑〔2〕、三環(huán)類抗抑郁藥〔3〕和選擇性5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制劑〔4〕。這些藥物的療效一般只有60%～70%，并且伴有許多副作用，臨床應用受到一定的局限〔5〕。因此，積極尋找特效、低毒、易透過血腦屏障的抑郁癥治療藥物成為當今我國乃至世界面臨的緊迫任務之一。柴胡是臨床上對抑郁癥治療應用廣泛且療效較好的藥物之一，柴胡皂苷A是其主要有效成分。本研究探討柴胡皂苷A的抗抑郁癥作用。

1材料與儀器

1.1實驗動物4~5月齡清潔級SD雄性大鼠60只，體重200～220 g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK(遼)2008-0002。

1.2試劑與藥品AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒由美國BIPE公司提供；柴胡皂苷A由南京朗澤醫(yī)藥科技公司提供；鹽酸氟西汀由中美合資中化藥品工業(yè)有限公司提供；SP免疫組化染色試劑盒由武漢博士德生物工程科技公司提供。

1.3儀器Medima-chine流式單細胞制備儀(美國BD公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)，EM208S透射電子顯微鏡(荷蘭菲利浦公司)。

1.4方法

1.4.1動物分組動物購回后在安靜、溫暖(18℃～20℃)、通風良好、無噪音和自然光照的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w。通過敞箱實驗將水平運動次數(shù)加垂直運動次數(shù)不足30次或超過120次的大鼠剔除，隨機分為正常對照組、模型組、西藥組和中藥組共4組，每組15只。

1.4.2造模方法模型組、西藥組和中藥組單籠飼養(yǎng)，同時進行21 d的慢性輕度不可預見性應激刺激：電擊足底(電流強度1 mA，電壓45 mV，持續(xù)時間10 s/次，共30次)、搖晃(1次/s,15 min)、冰水游泳(4℃,5 min)、熱應激(45℃,5 min)、夾尾(3 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、束縛(8 h)、晝夜顛倒、傾斜鼠籠與潮濕墊料(100 g墊料中加入200 ml水)。每天隨機安排1種刺激方式，每種刺激在實驗過程中使用不超過3次。正常對照組大鼠不予任何刺激。

1.4.3給藥方法造模同時，中藥組按25 mg·kg-1·d-1灌胃給予柴胡皂苷，1次/d，連續(xù)21 d。西藥組按1.2 mg·kg-1·d-1灌胃給予氟西汀，每日1次，共21 d。

1.4.4抑郁模型大鼠行為學評價Open-field測定方法：實驗裝置為高40 cm、底邊長80 cm、周壁涂黑、底板白色的無蓋方箱，底板用黑線劃成16 cm×16 cm的25個方格。每只動物單獨進行測定，每次測定時間為3 min，兩只動物之間用體積分數(shù)為10%的酒精清洗方箱周壁及底板。計分方法：將大鼠輕放于方箱底板中心，以大鼠穿越底面格數(shù)為水平活動得分，大鼠3只腳以上均在同一格子內(nèi)為一格，穿越一格計1分，如大鼠沿線行走，以每10 cm為1分；以大鼠直立次數(shù)為垂直活動得分，雙足離開底面為標志。糖水偏愛度的測定：24 h的禁食禁水后，測定1 h動物飲用1%蔗糖水和純水的量，然后應用公式：1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+純水消耗量)×100%，計算出各組大鼠糖水偏愛度值。

1.4.5免疫組化法測定大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)的蛋白表達大鼠灌注固定，斷頭取腦，分離海馬，固定，包埋，切片，加抗體，顯色，復染，脫水，封片，光鏡下觀察并用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)計算積分光密度。

1.4.6RT-PCR檢測BDNF mRNA分離海馬，提取RNA，檢測RNA純度及完整性。使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件分析各標本的的循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct值)。采用ΔCt法計算實驗結果，以2-ΔCt為 mRNA 的相對濃度，實驗組與對照組 mRNA 相對濃度的比值為實驗組mRNA表達相對于對照組的倍數(shù)。BDNF引物正義鏈：5′-CCCTTCTACACTTTACCTCTTG-3′，反義鏈：5′-GTTTCACCCTTTCCACTCCTA-3′。

1.4.7大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)超微結構的觀察大鼠斷頭取腦，以0.1 mol/L的PBS沖洗，10%鋨酸4℃冰箱后固定2 h，丙酮梯度脫水后丙酮+包埋劑(1∶1)浸透2 h，環(huán)氧樹脂包埋3 h，聚合37℃，12 h；45℃，22 h；60℃，16 h使之聚合硬化，切片，染色，觀察。

1.4.8大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的檢測大鼠腦海馬組織剪碎，制成細胞懸液，經(jīng)0.7 μm，200目規(guī)格的濾網(wǎng)過濾到離心管中，離心，去上清。加入緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)細胞濃度約1×106個/ml，用冰凍的PBS沖洗1次，離心，去上清。加入10 μl的AnnexinV-FITC和5 μl的Propidium Iodide，輕輕搖勻，室溫避光孵育15 min。加入400 μl上樣緩沖液液后，立即上流式細胞儀測定。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1各組大鼠行為學評價結果見表1~表3。與正常對照組相比，模型組水平運動得分、垂直運動得分和糖水偏愛度明顯降低(P<0.01,P<0.001),與模型組比較，西藥組和中藥組上述指標明顯升高(P<0.05;P<0.001)。

2.2柴胡皂苷A對大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白與mRNA表達的影響見表4，圖1。與正常對照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA及蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)，與模型組比較，西藥組、中藥組海馬區(qū)BDNF mRNA及與蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)。

表1　各組大鼠Open-Field實驗水平運動

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；與模型組比較：4)P<0.05,5)P<0.01，6)P<0.001，下表同

表2　各組大鼠Open-Field實驗垂直運動

表3　各組大鼠糖水偏愛度實驗數(shù)值比較 ± s,%， n=6)

與正常對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001；與模型組比較：3)P<0.01

表4　各組大鼠海馬區(qū)BDNF表達比較

與模型組比較：1)P<0.05；與西藥組比較：2)P<0.05

正常對照組

模型組

西藥組

中藥組

2.3柴胡皂苷A對大鼠海馬超微結構的影響電鏡下正常對照組神經(jīng)元胞核卵圓形，核膜清晰，核染色質(zhì)均勻，細胞器豐富；模型組神經(jīng)元胞體變小，胞核呈現(xiàn)皺縮改變，核膜凹凸不整，模糊不清，核染色質(zhì)增多，塊狀向邊緣聚集，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，空泡樣，可見大量脂褐素；西藥組神經(jīng)元核仁明顯，細胞器豐富，游離核蛋白體非常豐富，偶見脂褐素；中藥組神經(jīng)元胞體基本正常，核內(nèi)異染色質(zhì)減少，核周間隙基本正常，高爾基體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常。見圖2。

正常對照組(×40 000)

模型組(×20 000)

西藥組(×25 000)

中藥組(×25 000)

3討論

近年來抑郁癥病因學研究最具突破性的進展之一是“抑郁癥海馬神經(jīng)元再生障礙假說”的提出〔6〕，該假說認為抑郁癥的發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)可塑性失調(diào)密切相關，具體表現(xiàn)為神經(jīng)損傷與神經(jīng)發(fā)生障礙。海馬是腦內(nèi)重要邊緣系統(tǒng)結構之一，對應激反應非常敏感且易損傷，參與應激的神經(jīng)內(nèi)分泌反應和情緒調(diào)節(jié)。神經(jīng)病理學研究顯示，抑郁癥的病因與海馬區(qū)域神經(jīng)細胞的萎縮和壞死有關〔7〕，從而證實抑郁癥的發(fā)病與海馬結構關系密切。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家庭中的重要成員之一，廣泛分布于哺乳類動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，尤以海馬、皮層、杏仁核含量最高〔8〕，為公認的神經(jīng)可塑性的分子標記物。BDNF對多種類型的神經(jīng)元具有分化、增殖、營養(yǎng)、成熟的作用，尤其與多巴胺、膽堿能、5-HT神經(jīng)元的可塑性密切相關〔9〕。動物實驗發(fā)現(xiàn)應激和糖皮質(zhì)激素導致慢性應激抑郁癥時海馬BDNF表達下調(diào)，而BDNF對突觸有支持作用〔10〕。國內(nèi)外一些研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，抑郁癥患者血清BDNF水平較正常對照者低，且與抑郁程度、病程呈負相關，經(jīng)抗抑郁治療后血清BDNF水平上升，并且抑郁癥患者血清BDNF水平與病程及嚴重程度呈負相關。

中藥在治療情志性疾病方面有自己獨特的理論體系，也積累了不少臨床上有效的方藥。中醫(yī)認為，抑郁癥是由于情志不暢、氣機郁滯所引起的一類病癥。凡具有外感邪氣而內(nèi)著血脈或情致佛郁而內(nèi)著臟腑，以致氣機阻滯，進而誘發(fā)痰結、血瘀、火郁等癥者，多屬“郁癥”的范疇。本研究選取了針對抑郁癥發(fā)病的關鍵病機“肝郁氣滯”，選用了具有“疏肝解郁”作用的要藥柴胡，提取出它的主要有效成分柴胡皂苷進行抗抑郁作用的研究。本實驗結果顯示，柴胡皂苷可能通過調(diào)控BDNF，從而拮抗抑郁癥模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，這可能是柴胡皂苷治療抑郁癥的機制之一，但其抗抑郁癥的具體機制還有待于進一步研究。

參考文獻4

1Kendler KS，Gardner CO.Dependent stressful life events and prior depressive episodes in the prediction of major depression：the problem of causal inference in psychiatric epidemiology〔J〕.Arch Gen Psychiatry，2010；67(11)：1120-37.

2Adli M，Pilhatsch M，Bauer M，etal.Safety of high-intensity treatment with the irreversible monoamine oxidase inhibitor tranylcypromine in patients with treatment-resistant depression〔J〕.Pharmacopsychiatry，2008；41(6):252-7.

3Van Reedt Dortland AK，Giltay EJ，van Veen T，etal.Metabolic syndrome abnormalities are associated with severity of anxiety and depression and with tricyclic antidepressant use〔J〕.Acta Psychiatr Scand，2010；122(1):30-9.

4Andre K，Kampman O，Set?l?-Soikkeli E，etal.Temperament profiles，5-HT2A genotype，and response to treatment with SSRIs in major depression〔J〕.J Neural Transm，2010；117(12):1431-4.

5Sanford M，Boyle M，McCleary L，etal.A pilot study of adjunctive family psychoeducation in adolescent major depression：feasibility and treatment effect〔J〕.J Am Acad Child Adolesc Psychiatry，2006；45(4):386-95.

6Thomas RM，Peterson DA.A neurogenic theory of depression gains momentum〔J〕.Mol Interv，2003；3(8):441-4.

7McEwen BS.Plasticity of the hippocampus：adaptation to chronic stress and allostatic load〔J〕.Ann NY Acad Sci，2001；933(3):265-77.

8You J，Yuan Y，Zhang Z，etal.A preliminary association study between brain-derived neurotrophic factor (BDNF) haplotype and late-onset depression in mainland Chinese〔J〕.J Affect Disord，2010；120(1-3):165-9.

9Cheeran B，Talelli P，Mori F，etal.A common polymorphism in the brain-derived neurotrophic factor gene (BDNF) modulates human cortical plasticity and the response to rTMS〔J〕.J Physiol，2008；586(Pt 23):5717-25.

10Gómez-Casati ME，Murtie JC，Rio C，etal.Nonneuronal cells regulate synapse formation in the vestibular sensory epithelium via erbB-dependent BDNF expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2010；107(39):17005-10.

11Neumeister A.Tryptophandepletion,serotonin and depression:where do we stand〔J〕.Psyhopharmacol Bulletin，2003；37(4):99-115.

〔2013-09-15修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)