SK-7041對(duì)血管緊張素Ⅱ致大鼠心肌細(xì)胞肥大的干預(yù)作用

陸瑩肖剛1任鵬蔣桂華王新春

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科，黑龍江哈爾濱150086)

摘要〔〕目的探討SK-7041在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)致心肌細(xì)胞肥大過程中的抑制作用。方法常規(guī)方法培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，分為3組：對(duì)照組、肥大組、SK-7041組。利用AngⅡ刺激心肌細(xì)胞造成肥大模型，并給予SK-7041進(jìn)行干預(yù)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)觀察β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達(dá)；相差顯微鏡和電鏡觀察心肌細(xì)胞的表面積和超微結(jié)構(gòu)變化；免疫組織化學(xué)法檢測c-fos蛋白的表達(dá)。結(jié)果大鼠原代心肌細(xì)胞在AngⅡ作用下表面積增加，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；β-MHC mRNA和c-fos蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。給予SK-7041干預(yù)后，上述變化顯著緩解(P<0.05)。結(jié)論SK-7041可抑制AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞肥大，為臨床上治療心肌肥厚提供一條新的思路。

關(guān)鍵詞〔〕SK-7041；血管緊張素Ⅱ；心肌細(xì)胞；肥大

中圖分類號(hào)〔〕R542.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12511303)

通訊作者：肖剛(1971-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事心肌病發(fā)病機(jī)制的研究。

1解放軍第二一一醫(yī)院醫(yī)務(wù)處

第一作者：陸瑩(1971-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事心肌病發(fā)病機(jī)制的研究。

臨床上多種心血管疾病都伴有心肌肥大，如冠心病、高血壓性心臟病、風(fēng)濕性心臟病等等，但是對(duì)于心肌肥大的原因尚未完全明確。近年來研究表明，在心肌細(xì)胞肥大的信號(hào)傳導(dǎo)通路中，組蛋白脫乙?；?HDACs)發(fā)揮著重要作用〔1〕，其中Ⅰ類HDACs對(duì)于心肌肥大有一定的促進(jìn)作用〔2，3〕，因此對(duì)于其抑制劑的研究逐漸受到學(xué)者們的重視〔4〕。3-(4-取代苯基)-N-羥基-2-丙烯酰胺(SK-7041)作為新型Ⅰ類HDACs抑制劑，主要作用于Ⅰ類HDACs 中的HDAC1、HDAC2，目前僅被用于腫瘤性疾病的研究〔5〕，其在心血管疾病方面的作用尚未被研究。因此，本課題組以血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激心肌細(xì)胞造成肥大，給予SK-7041進(jìn)行干預(yù)，以觀察SK-7041對(duì)于心肌細(xì)胞肥大的抑制作用。

1材料與方法

1.1材料出生后1～3 d清潔級(jí)Wistar乳鼠，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào)：SYXK(黑)20020017。SK-7041(In2Gen/SK，Sigma公司)。DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。DMEM(美國Hyclone公司)。RT-PCR試劑盒(TakaRa公司)。RT-PCR引物由北京奧科公司合成。免疫組化SABC試劑盒(博士德公司)。兔抗大鼠c-fos多克隆抗體(Santa CruzBiotechnology Inc.USA)。

1.2心肌細(xì)胞培養(yǎng)和分組取出心臟后，剪成4～5塊，0.25% 胰酶反復(fù)消化、吸取上清，2 000 r/min離心10 min。加入含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，將細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù)。按細(xì)胞數(shù)106/ml或107/ml將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、肥大組和SK-7041組。96 h后換無血清培養(yǎng)液，同時(shí)SK-7041組加入SK-7041，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后肥大組和SK-7041組加入AngⅡ，使SK-7041終濃度為10-6mol/L，AngⅡ終濃度為2×10-7mol/L。37℃、5%CO2培養(yǎng)。加入AngⅡ后12 h和24 h進(jìn)行以下檢測。

1.3相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞面積變化加入AngⅡ后12 h和24 h于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，各組均隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選取10個(gè)心肌細(xì)胞，在1 600倍下應(yīng)用Motic Images1.3軟件測量心肌細(xì)胞面積，計(jì)算平均值。

1.4電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化胰酶消化細(xì)胞，用PBS液洗2次，2.5 %戊二醛固定，常規(guī)方法脫水、包埋、制作超薄切片、染色，在透射電鏡下觀察。

1.5反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA表達(dá)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。β-MHC基因引物序列：上游：5'-ACC AAG CAG CCA CGC CAG TA-3'；下游：5'-TGC TTT GCC TTT GCC CTT GT-3'；擴(kuò)增片段長度為596 bp。β-actin基因引物序列：上游：5'-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3'；下游：5'-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG-3'；擴(kuò)增片段長度為764 bp。以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果以β-MHC/β-actin比值表示。各組樣本數(shù)為10例。

1.6免疫組化法檢測c-fos蛋白表達(dá)冷丙酮固定各組心肌細(xì)胞20 min，置于0.3% H2O2中30 min抑制內(nèi)源性過氧化物酶。加入一抗4℃過夜。加入二抗，室溫下2 h。DAB顯色。蘇木素復(fù)染。乙醇脫水，二甲苯脫乙醇，封片。鏡下觀察，c-fos以細(xì)胞質(zhì)黃染為陽性。采用鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，分別計(jì)算c-fos表達(dá)陽性心肌細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

2結(jié)果

2.1SK-7041對(duì)心肌細(xì)胞表面積的影響在1 600倍鏡下，對(duì)照組、SK-7041組心肌細(xì)胞面積在12、24 h點(diǎn)均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組心肌細(xì)胞面積仍高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.2電鏡結(jié)果對(duì)照組可見心肌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核偏于一側(cè)，呈梭形；細(xì)胞內(nèi)肌絲排列整齊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核蛋白體豐富。肥大組可見心肌細(xì)胞體積較大，肌絲排列紊亂，線粒體內(nèi)膜髓鞘樣變；高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及扁平囊崩解。SK-7041組可見肥大的心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量的溶酶體，質(zhì)膜下粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張尤為明顯，細(xì)胞表面有質(zhì)膜葉片伸出，細(xì)胞核膜下有輕度染色質(zhì)的邊集。

2.3SK-7041對(duì)心肌細(xì)胞β-MHC mRNA表達(dá)的影響對(duì)照組、SK-7041組心肌細(xì)胞β-MHC mRNA表達(dá)在12、24 h點(diǎn)均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組仍高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表1　各組心肌細(xì)胞面積比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與肥大組比較：2)P<0.05；下表同

表2　各組心肌細(xì)胞β-MHC mRNA表達(dá)比較

2.4SK-7041對(duì)心肌細(xì)胞c-fos蛋白表達(dá)的影響對(duì)照組、SK-7041組心肌細(xì)胞c-fos蛋白表達(dá)在12、24 h點(diǎn)均低于肥大組(P<0.05)；但SK-7041組仍高于對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

表3　各組心肌細(xì)胞c-fos蛋白陽性表達(dá)比較

3討論

近年來，分子遺傳學(xué)、單細(xì)胞和器官生理學(xué)的進(jìn)展使得對(duì)涉及心肌肥大的各信號(hào)通路的研究日新月異，大量以基因工程技術(shù)處理過的動(dòng)物模型使人們能夠在分子水平上探索各個(gè)不同的信號(hào)途徑及其交匯聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)了許多在心肌肥大和心功能衰竭過程中起重要作用的信號(hào)通路。心肌細(xì)胞肥大是臨床多種心血管疾病所伴有的一種病理性改變，探討其發(fā)生的病理生理機(jī)制，對(duì)于治療有重要意義。AngⅡ、去甲腎上腺素等多種化學(xué)刺激亦可造成心肌細(xì)胞肥大，同時(shí)伴有c-fos、c-jun、c-myc等原癌基因表達(dá)迅速加強(qiáng)，并促使蛋白質(zhì)合成增加，誘導(dǎo)心肌肥大。本文表明，在AngⅡ誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞肥大模型中，心肌細(xì)胞表面積、c-fos蛋白和β-MHC基因的表達(dá)均增加，并出現(xiàn)了超微結(jié)構(gòu)的改變；給予SK-7041后減少了肥大心肌細(xì)胞的表面積，同時(shí)也降低了這一過程中的β-MHC mRNA和c-fos蛋白表達(dá)，從而證實(shí)了SK-7041對(duì)心肌細(xì)胞肥大的抑制作用。這一結(jié)果與其抑制特異性抑制Ⅰ類HDACs的作用相關(guān)。

目前認(rèn)為，心肌細(xì)胞核心組蛋白的乙?；?去乙?；c基因調(diào)控密切相關(guān)，催化組蛋白乙?；拿甘墙M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)，而催化組蛋白去乙?；拿甘荋DACs，二者作用相反。HDACs可通過移去組蛋白H3、H4賴氨酸殘基上的乙?；?，使帶正電荷的賴氨酸殘基暴露，后者與DNA之間的相互作用可限制核小體在DNA之間的移動(dòng)，進(jìn)而阻礙了作為基本轉(zhuǎn)錄單位的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)入啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)。由此可見，HDACs通過對(duì)組蛋白去乙?；墒笵NA結(jié)構(gòu)更加緊密，從而抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。HDACs分為三類，其中Ⅰ類HDACs中的HDAC1、2被認(rèn)為可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，而Ⅱ類HDACs可抑制心肌細(xì)胞肥大〔6~8〕。

SK-7041作為一種新型的Ⅰ類HDACs抑制劑，與其他非特異性HDACs抑制劑(如TSA、丙戊酸)相比，可特異性抑制Ⅰ類HDACs 中的HDAC1/2復(fù)合物。目前主要被應(yīng)用于研究腫瘤性疾病〔9〕，尚未見于心肌細(xì)胞肥大的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了推測：SK-7041可有效抑制心肌細(xì)胞肥大，進(jìn)一步說明HDAC1/2對(duì)于心肌肥大的促進(jìn)作用，同時(shí)希望能夠?yàn)樾募》蚀蟮陌l(fā)病機(jī)制研究提供一條新的思路。

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〔2013-09-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)