朱明明，賀 靜，樊明濤,*，王樹(shù)林

細(xì)菌類胡蘿卜素裂解酶酶解蝦青素工藝優(yōu)化

朱明明1，賀 靜1，樊明濤1,*，王樹(shù)林2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

目的：從巴氏葡萄球菌發(fā)酵液中分離純化可降解類胡蘿卜素產(chǎn)香的酶，優(yōu)化其降解蝦青素的反應(yīng)，為后續(xù)鑒定產(chǎn)物提供依據(jù)。方法：利用高效液相色譜分析產(chǎn)物產(chǎn)量變化，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用DPS軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，優(yōu)化蝦青素酶解反應(yīng)條件。結(jié)果：類胡蘿卜素裂解酶具有催化蝦青素降解的活性。反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及其交互作用對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量均有極顯著影響（P＜0.01），反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量影響最大，其通徑系數(shù)為12.726 9。利用二次多項(xiàng)式逐步回歸得到蝦青素酶解的最佳反應(yīng)條件：反應(yīng)pH 4.5、反應(yīng)時(shí)間7 min、反應(yīng)溫度50 ℃，在此條件下蝦青素產(chǎn)物的產(chǎn)量總和可達(dá)到定義條件下的1.75 倍。結(jié)論：該類胡蘿卜素裂解酶對(duì)蝦青素降解具有很強(qiáng)的催化活性，得到了產(chǎn)物達(dá)到最大產(chǎn)量時(shí)的最優(yōu)條件。

類胡蘿卜素裂解酶；蝦青素；產(chǎn)物產(chǎn)量；二次多項(xiàng)式逐步回歸

類胡蘿卜素是一類在自然界中廣泛存在的、由8 個(gè)異戊二烯單元相連、并且分子兩端各含有一個(gè)不飽和己烯環(huán)的一類四萜化合物的總稱，其中包括環(huán)化的或無(wú)環(huán)的胡蘿卜素，以及含有氧原子的胡蘿卜醇等[1-4]。蝦青素是一種紅色天然類胡蘿卜素，廣泛存在于鮭魚(yú)、蝦、蟹、觀賞魚(yú)和魚(yú)卵中以及植物葉、花和水果中[5-7]。蝦青素不僅具有著色功能[8-9]和抗氧化性[10-11]，也可氧化裂解產(chǎn)生香氣物質(zhì)。蝦青素的降解方法同類胡蘿卜素的降解方法，有物理降解（包括高溫氧化裂解、熱降解和光氧化降解等）、化學(xué)氧化降解和生物氧化（主要是酶催化降解）等[12-14]。經(jīng)過(guò)降解，可以生成如氧化異佛爾酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮類等C13化合物，這些化合物因?yàn)楦泄匍撝递^低而成為評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的重要指標(biāo)[15-18]。由于微生物酶對(duì)蝦青素（類胡蘿卜素）降解有高度選擇性[19-20]，降解產(chǎn)物大多為具有香氣的降異戊二烯化合物，所以，最近幾年在國(guó)際上頗受關(guān)注，已逐漸成為替代其理化降解的主要方法。

在改善沙棘酒香氣品質(zhì)的研究中，首次從沙棘汁分離得到一株具有可降解類胡蘿卜素特性的細(xì)菌（經(jīng)鑒定為巴氏葡萄球菌）[21]；對(duì)該細(xì)菌產(chǎn)生的類胡蘿卜素裂解酶[22-23]進(jìn)行分離純化并對(duì)其基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。為進(jìn)一步了解該類胡蘿卜素裂解酶的底物特異性，了解其對(duì)不同類胡蘿卜素底物的作用位點(diǎn)，需對(duì)降解中間產(chǎn)物進(jìn)行研究[24]。由于酶解的中間產(chǎn)物極其不穩(wěn)定，容易受時(shí)間、pH值和溫度影響而發(fā)生降解產(chǎn)生香氣物質(zhì)，因此為了得到中間產(chǎn)物最大產(chǎn)物量進(jìn)行后續(xù)研究和分析，本實(shí)驗(yàn)以蝦青素為底物，通過(guò)二次多項(xiàng)式逐步回歸[25-26]對(duì)該類胡蘿卜素裂解酶降解蝦青素的產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化，獲得最大產(chǎn)物量，并進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì) 譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析，以期為研究底物特異性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室分離保存的巴氏葡萄球菌菌株TS-82。

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%） 美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Tidia公司；甲基叔丁基醚（色譜純） 上海Aladdin試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素裂解酶純酶的制備

在37 ℃、130 r/min條件下，將TS-82在改良查氏培養(yǎng)基[22]中培養(yǎng)12 h。將所得發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。粗酶液經(jīng)過(guò)冷凍干燥濃縮后依次上樣于Mono Q10/100柱，高效制備液相色譜和Superdex peptide 10/300多肽分子篩對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到單一的類胡蘿卜素裂解酶純酶。

1.3.2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制

實(shí)驗(yàn)中以蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品為底物。將5 mg蝦青素和1 g吐溫-80溶于20 mL的二氯甲烷溶液中，避光條件下，在通風(fēng)櫥中不斷振蕩直至二氯甲烷揮發(fā)干凈，加入52 mL無(wú)菌蒸餾水混勻，得橘黃色、清澈的儲(chǔ)備液，放置在4 ℃冰箱中待用。該儲(chǔ)備液濃度為160 μmol/L。

1.3.3 體外蝦青素酶解

將15 μg的純酶與280 μmol的底物混合，用蒸餾水定容至2 mL，在反應(yīng)溫度30 ℃，pH 5.0條件下反應(yīng)30 min，加入2 倍體積的丙酮溶液終止反應(yīng)[19]。接著向反應(yīng)物中加入2 倍體積的正己烷溶液，混合均勻，放置5 min后，5 000×g離心5 min，取上清液即提取出蝦青素及其酶解產(chǎn)物。將上清液在真空離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)干燥，得到的殘余物溶解于2 mL丙酮溶液中，置于4 ℃條件下保存，用于HPLC分析。

1.3.4 蝦青素酶解的單因素試驗(yàn)

體外實(shí)驗(yàn)中均采用280 μmol底物和15 μg純酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)體積2 mL。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和參考文獻(xiàn)[24]，選取了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度為考察因素進(jìn)行酶解反應(yīng)。該類胡蘿卜素裂解酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適反應(yīng)pH值為3.0、由于反應(yīng)溫度過(guò)高或反應(yīng)pH值過(guò)低時(shí)，中間產(chǎn)物都極其容易降解，故設(shè)定如下考察范圍：設(shè)定反應(yīng)溫度30 ℃、反應(yīng)pH 5.0，考察反應(yīng)時(shí)間0、15、30、45、60 min對(duì)蝦青素中間產(chǎn)物相對(duì)含量的影響，以反應(yīng)15 min時(shí)得到的2 個(gè)產(chǎn)物的總相對(duì)含量為100%；設(shè)定反應(yīng)溫度30 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min，考察反應(yīng)pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0對(duì)蝦青素中間產(chǎn)物相對(duì)含量的影響，以pH 5.0條件下獲得的2 個(gè)產(chǎn)物的總相對(duì)含量為100%；設(shè)定反應(yīng)pH 5.0、反應(yīng)時(shí)間30 min，考察反應(yīng)溫度30、40、50、60、70 ℃對(duì)蝦青素中間產(chǎn)物相對(duì)含量的影響，以反應(yīng)溫度30 ℃條件下得到的2 個(gè)產(chǎn)物的總相對(duì)含量為100%。按照1.3.3節(jié)方法終止反應(yīng)并提取蝦青素和酶解產(chǎn)物。

1.3.5 蝦青素酶解的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法安排蝦青素酶解產(chǎn)物條件優(yōu)化的試驗(yàn)，其因素水平具體見(jiàn)表1，通過(guò)考察蝦青素酶解產(chǎn)物的相對(duì)含量確定最佳的反應(yīng)條件。

表 1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Factors and their coded levels used in orthogonal array design

1.3.6 蝦青素酶解反應(yīng)的測(cè)定

1.3.6.1 色譜條件

采用HPLC法[19]測(cè)定底物的降解和產(chǎn)物的生成。色譜柱：C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相A：甲醇-水-甲基叔丁基醚體積比30∶10∶1，流動(dòng)相B：甲醇和甲基叔丁基醚等體積混合，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～30 min，0%～100%B，30～35 min，100%B，35～36 min，100%～0%B，36～51 min，0%B；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)460 nm。

1.3.6.2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及含量測(cè)定

將蝦青素儲(chǔ)備液分別稀釋至40、80、120 μmol/L和160 μmol/L，以蒸餾水做空白，按照1.3.3節(jié)提取方法提取蝦青素，根據(jù)1.3.6.1節(jié)色譜條件得到不同底物濃度的峰面積，用所得數(shù)據(jù)作圖可得蝦青素溶液濃度與峰面積的線性關(guān)系。

1.3.6.3 底物轉(zhuǎn)化率

將15 μg純酶與280 μmol底物混合，用蒸餾水定容至2 mL，反應(yīng)30 min，測(cè)定30 min內(nèi)蝦青素的降解量。底物轉(zhuǎn)化率定義為在上述條件下每分鐘底物的降解量，單位μg/min。

1.3.6.4 產(chǎn)物相對(duì)含量

通過(guò)檢測(cè)波長(zhǎng)460 nm條件下產(chǎn)物的峰面積可得到產(chǎn)物含量的變化。由于產(chǎn)物還未鑒定，故采用相對(duì)含量表示。實(shí)驗(yàn)中選用2 個(gè)產(chǎn)物的峰面積總和代表產(chǎn)量總和。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，定義最優(yōu)條件下得到的2 個(gè)產(chǎn)物峰面積總和為100%，其余條件獲得的產(chǎn)物峰面積總和換算為相對(duì)含量。

以上所有反應(yīng)均為3 次平行，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素酶解反應(yīng)

圖 1 蝦青素酶解產(chǎn)物的液相色譜圖Fig.1 HPLC analysis of astaxanthin cleavage products by purified carotenoid cleavage enzyme in vitro assays

從圖1可以看出，類胡蘿卜素裂解酶具有很強(qiáng)的催化活性，反應(yīng)30 min可看到顏色明顯發(fā)生變化。圖1a與圖1b的結(jié)果相比可看出，蝦青素（X）含量明顯降低，表明類胡蘿卜素裂解酶可以顯著地催化降解蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，而在蝦青素保留時(shí)間后的2 個(gè)峰的含量明顯增加，即生成產(chǎn)物1和2（命名為X1和X2）。同時(shí)測(cè)定了產(chǎn)物X1和X2在HPLC洗脫液中的最大吸收波長(zhǎng)，其波長(zhǎng)分別是472 nm和466 nm。

根據(jù)圖1中蝦青素含量的變化計(jì)算出30 min的轉(zhuǎn)化率為51.12%。與該酶作用于其他底物的催化效率相比，作用于蝦青素的催化效率與角黃素（52.84%）的效率相當(dāng)，高于作用于β-8′-胡蘿卜醛（22.73%）和β-胡蘿卜素（40.4%），但低于作用于玉米黃質(zhì)（71.78%）的催化效率[24]，這與Hoffmann等[19]發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜裂解酶對(duì)蝦青素的催化效率遠(yuǎn)高于玉米黃質(zhì)和角黃素的催化效率有一定的差異。對(duì)于該酶對(duì)玉米黃質(zhì)具有較好的催化活性的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

2.2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以波長(zhǎng)460 nm處得到的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為橫坐標(biāo)，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析。得回歸方程：y=0.02x-3.827（R2=0.985），式中：x為蝦青素的峰面積；y為蝦青素濃度/（μmol/L）。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖 2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蝦青素酶解中間產(chǎn)物相對(duì)含量的影響Fig.2 Effects of incubation time on the relative content of apocarotenoids

2.3.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)中間產(chǎn)物X1和X2相對(duì)含量的影響由圖2可看出，反應(yīng)時(shí)間對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量有極顯著影響（P＜0.01）。反應(yīng)初期隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦青素中間產(chǎn)物相對(duì)含量增加，這是因?yàn)槊复呋r青素降解產(chǎn)生中間產(chǎn)物。反應(yīng)15 min時(shí)，中間產(chǎn)物相對(duì)含量最高。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，中間產(chǎn)物相對(duì)含量開(kāi)始下降。這可能因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，中間產(chǎn)物自身不穩(wěn)定，發(fā)生降解，因此反應(yīng)時(shí)間選擇15 min為宜。

2.3.2 反應(yīng)pH值對(duì)中間產(chǎn)物X1和X2相對(duì)含量的影響

圖 3 反應(yīng)pH值對(duì)蝦青素酶解產(chǎn)物含量（a）、蝦青素轉(zhuǎn)化率（b）的影響Fig.3 Effects of pH on the relative content of apocarotenoids and the conversion efficiency of astaxanthin

如圖3a所示，反應(yīng)pH值對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量的變化有極顯著影響（P＜0.01），反應(yīng)pH值為5.0時(shí)，中間產(chǎn)物相對(duì)含量最高。pH值大于5.0后中間產(chǎn)物相對(duì)含量明顯降低，這與pH值過(guò)高，酶活性受到抑制導(dǎo)致蝦青素轉(zhuǎn)化率降低相關(guān)。而pH值小于5.0時(shí)中間產(chǎn)物相對(duì)含量也出現(xiàn)明顯降低，分析其原因可能是由于中間產(chǎn)物易受pH值影響，在酸性條件下不穩(wěn)定，發(fā)生降解。同時(shí)考察不同pH值對(duì)蝦青素酶解轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3b。隨著pH值的升高，蝦青素轉(zhuǎn)化率逐步降低，這與該酶在酸性環(huán)境中的催化作用較強(qiáng)一致。當(dāng)pH值達(dá)到6.0時(shí)，蝦青素轉(zhuǎn)化率幾乎為0，這是因?yàn)樵擃惡}卜素裂解酶的最適反應(yīng)pH值為3.0，而在pH值達(dá)到6.0時(shí)幾乎完全失活造成的。

由于底物轉(zhuǎn)化率只與類胡蘿卜素裂解酶活性相關(guān)，而中間產(chǎn)物不僅受酶活影響，所處環(huán)境條件對(duì)其穩(wěn)定性也有顯著性影響，在酸性條件下很不穩(wěn)定，極其容易降解[24]。雖然催化活性高，底物含量大大減少，但中間產(chǎn)物一方面在酸性條件下不穩(wěn)定，另一方面酶活性變高，而時(shí)間還是15 min時(shí)，中間產(chǎn)物已發(fā)生降解，兩方面導(dǎo)致產(chǎn)量也大大減少，轉(zhuǎn)化為具有香氣物質(zhì)的終產(chǎn)物，因此并不是轉(zhuǎn)化率越高，中間產(chǎn)物相對(duì)含量越高，故從得到中間產(chǎn)物的最大相對(duì)含量考慮，反應(yīng)pH值選擇5.0。2.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)中間產(chǎn)物X1和X2相對(duì)含量的影響

由圖4a看出，反應(yīng)溫度對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量變化有極顯著影響（P＜0.01）。反應(yīng)溫度30 ℃時(shí)，中間產(chǎn)物相對(duì)含量最高。隨著溫度的升高，中間產(chǎn)物相對(duì)含量顯著降低，這是因?yàn)橹虚g產(chǎn)物極其不穩(wěn)定，溫度越高，其自身降解越快。而在溫度低于30 ℃時(shí)，由于酶的活性受到抑制，導(dǎo)致催化效率低，致使中間產(chǎn)物相對(duì)含量較低。同時(shí)考察不同溫度對(duì)蝦青素酶解轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4b。反應(yīng)溫度在30～60 ℃時(shí)蝦青素轉(zhuǎn)化率升高較快，而后隨著溫度上升，轉(zhuǎn)化率幾乎不變，在溫度高于70 ℃后蝦青素轉(zhuǎn)化率降低，這可能因?yàn)殡m然隨著反應(yīng)溫度的升高，酶的活性增加，催化蝦青素快速降解，但溫度過(guò)高破壞了酶的結(jié)構(gòu)，使酶失活，從而影響蝦青素的降解。

圖 4 反應(yīng)溫度對(duì)蝦青素酶解產(chǎn)物含量（a）、蝦青素轉(zhuǎn)化率（b）的影響Fig.4 Effects of temperature on the relative content of apocarotenoids and the conversion efficiency of astaxanthin

由于底物轉(zhuǎn)化率只與類胡蘿卜素裂解酶活性相關(guān)，而中間產(chǎn)物不僅受酶活影響，所處環(huán)境條件對(duì)其穩(wěn)定性也有顯著影響，一方面在高溫條件下很不穩(wěn)定，極其容易降解[24]，另一方面酶活性變高，底物轉(zhuǎn)化率升高，但依舊15 min時(shí)中間產(chǎn)物已發(fā)生降解，因此并不是轉(zhuǎn)化率越高，中間產(chǎn)物相對(duì)含量越高，即從酶的活性和中間產(chǎn)物穩(wěn)定性兩方面考慮，選擇反應(yīng)溫度為30 ℃。

2.4 正交試驗(yàn)及二次多項(xiàng)式逐步回歸分析

2.4.1 二次多項(xiàng)式回歸方程的建立

表 2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal array design

通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察了反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量的影響后，選用正交試驗(yàn)探討這3 個(gè)因素對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，由DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)擬合得出數(shù)學(xué)模型的回歸方程：

Y=-1 064.22 ＋1 030.33X1-42.74X2-51.44X3-125.63X1X1-0.16X2X2＋0.70X3X3＋10.90X1X2-0.15X2X3

（式中：Y是2 個(gè)中間產(chǎn)物相對(duì)含量總和；此時(shí)定義反應(yīng)時(shí)間30 min、pH 5.0、溫度30 ℃條件下的相對(duì)含量為100%）。同時(shí)得到二次多項(xiàng)式逐步回歸方程的相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)：相關(guān)系數(shù)R=0.997 7、F=490.501 3、P=0.000 1，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=0.996 7，剩余標(biāo)準(zhǔn)差s=3.426 1，Durbin-Waston統(tǒng)計(jì)量d=1.945 206 93。由以上回歸方程統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)可以看出，回歸方程能夠正確反映各因素與中間產(chǎn)物相對(duì)含量之間的關(guān)系，可靠性較高，同時(shí)因?yàn)镽＞Ra，Y回歸效果顯著。

2.4.2 反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及其交互作用對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量的影響

表 3 優(yōu)化條件下各因素與中間產(chǎn)物相對(duì)含量的直接通徑系數(shù)Table 3 Direct path coefficients between main factors and the yield of apocarotenoids under optimized reactionconditions

從各影響因素的方程回歸系數(shù)來(lái)看，反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度與中間產(chǎn)物相對(duì)含量的相關(guān)性與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，而反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間的交互作用與中間產(chǎn)物相對(duì)含量呈正相關(guān)關(guān)系，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的交互作用與中間產(chǎn)物相對(duì)含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

在回歸方程條件下，各因素與中間產(chǎn)物相對(duì)含量的直接通徑系數(shù)見(jiàn)表3。各因素對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量的相對(duì)重要性按直接通徑系數(shù)（絕對(duì)值）從大到小排序依次是X1X2、X1、X3、X2、X2X3（X1與合并，X3與合并，X2與X22合并），即反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間的交互作用（X1X2）對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量的影響較大，而反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的交互作用（X2X3）對(duì)其影響較小。

2.4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

回歸方程最終得到最高指標(biāo)時(shí)各個(gè)因素組合為Y=194.844 6、X1=4.5、X2=7、X3=50，即反應(yīng)pH值為4.5、反應(yīng)時(shí)間7 min、反應(yīng)溫度50 ℃，在此條件下的中間產(chǎn)物相對(duì)含量為定義條件下的2 倍。為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化酶解反應(yīng)條件進(jìn)行蝦青素酶解反應(yīng)，3 次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際中間產(chǎn)物相對(duì)含量為定義條件下的1.75 倍，與最優(yōu)理論值相近，比9 組試驗(yàn)數(shù)據(jù)都高，說(shuō)明此優(yōu)化結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)有一定的價(jià)值。

3 結(jié) 論

巴氏葡萄球菌菌株TS-82分離純化得到的類胡蘿卜素裂解酶具有催化蝦青素降解產(chǎn)香的功能，其中間產(chǎn)物X1和X2可通過(guò)HPLC檢測(cè)到，最大吸收波長(zhǎng)分別是472 nm和466 nm。反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及其交互作用對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量均有極顯著作用（P＜0.01），在優(yōu)化條件下，反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對(duì)中間產(chǎn)物相對(duì)含量影響最大，其通徑系數(shù)為12.726 9。二次多項(xiàng)式逐步回歸優(yōu)化蝦青素酶解的最佳工藝條件為反應(yīng)pH值4.5、反應(yīng)時(shí)間7 min、反應(yīng)溫度50 ℃，按此條件，蝦青素中間產(chǎn)物相對(duì)含量可達(dá)到定義條件下的1.75 倍。該方法可以提高產(chǎn)物含量，節(jié)省時(shí)間，為進(jìn)一步研究產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和該酶的催化機(jī)理提供依據(jù)。

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Optimization of Conditions for Astaxanthin Cleavage by a Bacterial Carotenoid Cleavage Enzyme

ZHU Mingming1, HE Jing1, FAN Mingtao1,*, WANG Shulin2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016, China)

Objective: This work aimed to optimize the conditions for the degrada t ion of astaxanthin by a purifi ed carotenoid cleavage enzyme from Staphylococcus pasteuri. Methods: The degradation products were measured by HPLC. Orthogonal arrays design combined with quadratic polynomial stepwise regression analysis was applied to optimize the conditions for astaxanthin degradation. Results: The HPLC analysis showed that this carotenoid cleavage enzyme had the ability to degrade astaxanthin. pH, time, temperature and their interactions had significant effects on the contents of degradation products (P ＜ 0.01). The interaction between pH and time showed the most signifi cant contribution to the contents of degradation products under the optimized conditions with a value of direct path coeffi cient of 12.726 9. The optimal reaction conditions were determined as follows: pH 4.5, and incubation at 50 ℃ for 7 min. Under these conditions, the total yield of degradation products was 1.75 times higher than the defi ned apocarotenoids yield. Conclusion: This carotenoid cleavage enzyme has a high ability to cleave astaxanthin. The optimal conditions for maximum yield of products have been obtained.

a carotenoid cleavage enzyme; astaxanthin; yield of apocarotenoids; quadratic polynomial stepwise regression analysis

Q556

A

1002-6630（2015）08-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201508001

2014-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171728）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31060225）

朱明明（1989—），女，博士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：happyzhumingming@126.com

*通信作者：樊明濤（1963—），男，教授，博士，主要從事食品微生物及食品安全研究。E-mail：fanmt@nwsuaf.edu.cn