李 斌

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

Alcalase酶解狼山雞肉蛋白規(guī)律

李 斌

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

以狼山雞為實驗材料，分析Alcalase酶解雞肉蛋白規(guī)律。結(jié)果表明：酶解雞肉蛋白的最適酶解溫度為45 ℃、酶添加量為2.0 U/g、酶解時間為4 h；酶解過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白有較多的氨基酸釋放，并且可溶性氮也有大量的累積，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要集中在30～50 kD之間；在酶解產(chǎn)物中含量最高的氨基酸分別為天冬氨酸和谷氨酸，并且在酶解產(chǎn)物中親水性氨基酸（hydrophilic amino acid，HLAA）與疏水性氨基酸（hydrophobic amino acid，HBAA）比值在1.41～1.52之間；通過對酶解產(chǎn)物游離氨基酸營養(yǎng)價值的分析，在不同酶解時間的酶解產(chǎn)物中含有豐富的必需氨基酸，該必需氨基酸指數(shù)與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）推薦的成人理想氨基酸模式相類似。

狼山雞；堿性蛋白酶；蛋白質(zhì)水解；游離氨基酸

蛋白質(zhì)酶解是指蛋白質(zhì)在酶的作用下降解成肽類或更小分子質(zhì)量的氨基酸的過程[1-2]，是改造蛋白質(zhì)、提高蛋白質(zhì)價值的最有效途徑之一，具有酶解條件溫和、產(chǎn)物安全性高、營養(yǎng)價值高、易消化、易與其他風(fēng)味物質(zhì)搭配等優(yōu)點，已成為當(dāng)今蛋白質(zhì)領(lǐng)域最大的發(fā)展方向之一[3-5]。肌漿蛋白、肌原纖維蛋白是構(gòu)成雞肉蛋白的主要成分，任何蛋白酶的酶解規(guī)律都體現(xiàn)著雞肉蛋白的水解規(guī)律[6-7]，對于酶解蛋白的規(guī)律及原理的研究是合理利用酶解產(chǎn)物的前提[8-9]。蛋白質(zhì)的分解程度可由蛋白質(zhì)水解指數(shù)反映，為決定蛋白酶解產(chǎn)物的具體應(yīng)用領(lǐng)域、確定其營養(yǎng)價值，有必要對酶解產(chǎn)物中的一些諸如氮的存在形式、氨基酸種類等宏觀指標(biāo)進(jìn)行宏觀的分析，以確定酶解產(chǎn)物的存在形式。對于Alcalase，目前已經(jīng)有很多文獻(xiàn)對其做出報道[10-11]。研究表明，在水解動物蛋白（如魚蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等）無論是從技術(shù)和經(jīng)濟(jì)及原料來源角度而言，Alcalase是最高效酶之一，其中最廣泛的應(yīng)用主要是在魚肉蛋白中[12-14]。此外，Alcalase因其作用位點的多樣性而被廣泛應(yīng)用到酶解動物蛋白中[15]。目前，Alcalase對肌肉蛋白水解的過程及產(chǎn)物的研究較少。因此，本實驗以Alcalase為雞肉原料水解酶，通過研究酶解過程中可溶性氮、氨基酸和肽基氮的釋放模式，以深入研究雞肉蛋白的酶解機(jī)理，理解雞肉蛋白酶解產(chǎn)物中營養(yǎng)價值的釋放規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狼山雞（雞齡365 d）由南通市雙和食品有限公司提供，取同一批雞胸肉剔除肌膜，切碎混勻，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Alcalase 2.4 L（酶活力＞200×104U/g） 丹麥諾維信公司；乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Tris、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍(lán)、巰基乙醇、過硫酸胺美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；2300型KjeltecTM自動凱氏定氮儀、KDN-04消化爐 丹麥Foss分析儀器公司；SPX-250C型恒溫恒濕箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FR-980生物電泳圖象分析系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；602S穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；JA2203N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；氨基酸自動分析儀日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 Alcalase酶解雞肉蛋白條件的確定

酶添加量：稱取雞胸肉10 g按照酶添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U/g加酶溶液后（肉液比為1∶1.5，m/V）置于45 ℃水浴中，酶解4 h后分別測定產(chǎn)物中蛋白質(zhì)水解指數(shù)。

酶解溫度：稱取雞胸肉10 g加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）分別置于25、30、35、40、45、50、55 ℃水浴中反應(yīng)，酶解4 h后分別測定產(chǎn)物中蛋白質(zhì)水解指數(shù)。

酶解時間：稱取雞胸肉10 g加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）置于45 ℃水浴中分別酶解0、2、4、6、8、10 h后分別測定產(chǎn)物中蛋白質(zhì)水解指數(shù)。

1.3.2 Alcalase酶解雞肉蛋白規(guī)律研究

蛋白組分分解變化：分別將提取的肌漿蛋白、肌原纖維蛋白各5 g，加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）置于45 ℃水浴中分別酶解1、2、3、4、5、6 h，分別測定蛋白質(zhì)水解指數(shù)。

氮的存在形式：分別將提取的肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、基質(zhì)蛋白各5 g，加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）置于45 ℃水浴中分別酶解1、2、3、4、5、6 h，分別測定酶解液中氨基態(tài)氮、可溶性氮和肽基氮的含量。

酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析酶解1、2、3、4、5、6 h后蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。

氨基酸釋放規(guī)律：稱取雞胸肉5 g加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）置于45 ℃水浴中分別酶解0、1、2、3、4 h后分別用氨基酸自動分析儀測定酶解產(chǎn)物中的氨基酸組成。

1.3.3 指標(biāo)分析

1.3.3.1 肌漿蛋白提取

稱取2 g剪碎肉樣，加入20 mL 0.02 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），高速分散器勻漿（6 000 r/min，3 min），冷凍離心（10 000×g，4 ℃，20 min），吸取上清液即為肌漿蛋白[16]。

1.3.3.2 肌原纖維蛋白提取

上述離心沉淀物重新懸浮于0.03 mol/L pH 6.5的PBS中，在高速分散器中勻漿（6 000 r/min，4 min），然后離心（10 000×g，4 ℃，20 min），去除上清液，重復(fù)以上操作3 次，目的是為了除去肌肉中的內(nèi)源蛋白酶，最終沉淀再次懸浮于8 mL 0.1 mol/L pH 6.5的PBS中，另加入KI和NaN3使最終濃度和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.7 mol/L和0.02%，懸浮液在高速分散器中勻漿（7 000 r/min，3 min），然后離心（10 000×g，4 ℃，20 min），吸取上清即為肌原纖維蛋白[16]。

1.3.3.3 蛋白質(zhì)水解指數(shù)測定[17]

總氮（total nitrogen，TN）含量測定：樣品解凍絞碎后，稱取1 g（精確到0.001 g）于消化管中，加12 mL濃硫酸及1 片消化片于消化管中，420 ℃消化1.5 h，冷卻后用自動凱氏定氮儀測定TN含量。

非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）含量測定：樣品解凍絞碎后，取5 g（精確到0.001 g）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）25 mL，高速分散器勻漿3 次（5 000 r/min，20 s/次），4 ℃放置過夜，冷凍離心（4 ℃，5 000×g，5 min），過濾，取濾液于消化管中，加5 mL濃硫酸于220 ℃烘水1 h，再加硫酸7 mL，420 ℃消化1.5 h，冷卻后用自動凱氏定氮儀測定NPN。蛋白質(zhì)水解指數(shù)（proteolysis index，PI）按式（1）計算。

1.3.3.4 不同存在形式氮含量測定

可溶性氮含量測定：采用微量凱氏定氮法測定水解產(chǎn)物上清液中氮的含量，以占總氮含量百分比表示。

氨基態(tài)氮含量測定：水解產(chǎn)物中氨基態(tài)氮含量采用甲醛電位滴定法測定，以占總氮含量百分比表示[18]。

肽基氮含量測定：水解產(chǎn)物中肽基氮的含量=可溶性氮含量－氨基態(tài)氮含量。

1.3.3.5 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定

利用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，必要時稀釋一定倍數(shù)。SDS-PAGE[16]測定分子質(zhì)量分布：將酶解后的蛋白產(chǎn)物配制成蛋白樣品并與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，10%分離膠，5%濃縮膠，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，Quantity-One分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。

1.3.3.6 游離氨基酸總量（total free amino acid，F(xiàn)AA）測定

參考Virgili等[19]的方法，略作修改：準(zhǔn)確稱取樣品6.00 g，加入60 mL 0.2 mol/L PBS（pH 6.5），勻漿（6 000 r/min，3 min），離心（10 000×g，4 ℃，20 min），取上清液0.5 mL，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%水楊酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0，加入0.25 mL雙蒸水，離心（15 000×g，4 ℃，20 min），取上清液0.5 mL，使用0.02 mol/L鹽酸稀釋5～10 倍，用氨基酸自動分析儀檢測。檢測條件：洗脫液為檸檬酸緩沖液（pH 3.3～4.9），顯色液為茚三酮-乙二醇甲醚-乙酸鈉緩沖液（2∶75∶25，V/V），除羥脯氨酸在440 nm波長處檢測外，其余氨基酸均在570 nm波長處檢測。

1.3.3.7 氨基酸評分（amino acid score，AAS）計算

根據(jù)Liaset等[20]的方法確定酶解產(chǎn)物的營養(yǎng)價值，具體為：采用聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）推薦的蛋白質(zhì)模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用Origin 8.0進(jìn)行作圖分析。不同平均值之間用SAS 8.2（SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, USA）統(tǒng)計軟件的GLM程序（general linear model procedure）中的鄧肯氏多重比較法（Duncan’s multiple range test）進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alcalase酶解雞肉蛋白條件分析

圖1 不同酶解條件對雞肉蛋白質(zhì)水解的影響Fig.1 Effects of different enzymatic hydrolysis conditions on PI

由圖1a可知，隨著酶解溫度的升高蛋白質(zhì)水解指數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。Alcalase作為一種耐高溫酶，在一定的底物和Alcalase酶添加量下，雞肉蛋白質(zhì)水解指數(shù)隨著溫度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溫度在45 ℃左右時酶解蛋白達(dá)到30%，當(dāng)酶解溫度高于45 ℃時，蛋白質(zhì)的分解逐漸降低，該趨勢與Alcalase酶活性的趨勢大致相同[21]。

由圖1b可知，隨著酶添加量的增加蛋白水解指數(shù)呈上升趨勢，當(dāng)酶添加量增加到2.0 U/g時，趨勢略有降低，但蛋白質(zhì)水解指數(shù)也有顯著增長（P= 0.013＜0.05），主要是因為Alcalase底物專一性較低，隨著酶添加量的增加，大量的底物被分解。這與成堃等[22]對堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究基本相同，當(dāng)酶添加量增加到2 U/g左右時，蛋白水解指數(shù)大約為32%。另外，由圖1c可知，隨著酶解時間的延長，雞肉蛋白質(zhì)逐漸被分解，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)水解指數(shù)的增大，非蛋白氮的逐漸積累。當(dāng)酶解時間在4 h左右后，蛋白質(zhì)水解指數(shù)無顯著的增加趨勢（P＝0.137＞0.05），此時蛋白水解指數(shù)大約為30%，主要原因是Alcalase酶的熱穩(wěn)定性在4 h后降低，這與趙謀明等[23]對不同酶解雞肉蛋白隨酶解時間變化的規(guī)律一致。

2.2 Alcalase酶解雞肉蛋白過程分析

2.2.1 酶解產(chǎn)物分解變化

圖2 肌漿蛋白酶解產(chǎn)物的氮存在形式Fig.2 Existing forms of nitrogen in sarcoplasmic protein during enzymatic hydrolysis

由圖2可知，隨著酶解時間的延長，肌漿蛋白中3 種氮的存在形式都有不同程度的累積。對于可溶性氮，在酶解4 h前有顯著增加趨勢（P＜0.05），在酶解時間大于4 h后，該趨勢趨于平緩；氨基態(tài)氮在整個過程中都有累積；而肽基氮在4 h后出現(xiàn)了一定程度的降低。酶解4 h，部分肌漿蛋白被分解，3 種氮的存在形式都在累積；在4 h后，酶的熱穩(wěn)定性降低或構(gòu)象的改變使酶活力降低，部分肽類物質(zhì)在該溫度內(nèi)繼續(xù)分解，表現(xiàn)為肽基氮的含量減少，氨基態(tài)氮的積累。

圖3 肌原纖維蛋白酶解產(chǎn)物的氮存在形式Fig.3 Existing forms of nitrogen in myofibrillar protein during enzymatic hydrolysis

由圖3可知，肌原纖維蛋白的酶解產(chǎn)物中可溶性氮、氨基態(tài)氮、肽基氮的含量都在上升。在1～4 h內(nèi)，產(chǎn)物中3 種氮都保持較快的增長速率，尤其是可溶性氮，在1～4 h中由22.5%增長到50%，在酶解4 h后，也有部分增長，表明Alcalase對肌原纖維蛋白有較大的酶解作用；肽基氮在酶解4 h后含量趨于平緩，占總氮的20%左右；氨基態(tài)氮的含量一直累積，在整個過程中有顯著增加趨勢（P＜0.05），在酶解6 h后達(dá)到30%。

2.2.2 酶解雞肉蛋白過程電泳分析

圖4 不同酶解過程中酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profiles of hydrolyzed products after different hydrolysis times

由圖4可知，隨著酶解過程的進(jìn)行，酶解產(chǎn)物中高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)被降解，低分子質(zhì)量蛋白不斷生成。在酶解1 h后，95 kD所有的蛋白條帶消失，40～90 kD以及35 kD附近出現(xiàn)兩條較低分子質(zhì)量的條帶，隨著酶解過程的進(jìn)行，伴隨著49 kD條帶的加深及35 kD條帶的出現(xiàn)，90 kD附近條帶消失，在酶解4 h后，并無條帶消失和新條帶的出現(xiàn)，在酶解6 h時，35 kD左右處蛋白累積，出現(xiàn)這現(xiàn)象的原因可能是溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)的水解。表明Alcalase能夠降解狼山雞肉蛋白，可以用于狼山雞肉的酶解開發(fā)。

2.2.3 不同酶解過程中氨基酸釋放規(guī)律的研究

Alcalase酶解狼山雞肉蛋白過程中酶解產(chǎn)物氨基酸組成見表1。從整個酶解過程來看，隨著酶解過程的進(jìn)行，氨基酸總量呈明顯的上升趨勢，并且產(chǎn)物中各種氨基酸的含量也有明顯的增加，氨基酸總量在酶解4 h后由1 095.50 mg/100 mL增加到1 870.33 mg/100 mL，約增加了1.71 倍。從各時期不同氨基酸占氨基酸總量來看，在酶解過程中占總量最多的是谷氨酸、組氨酸和天冬氨酸，這3 種成分總量占氨基酸總量的35%左右，這正是狼山雞味道鮮美的主要原因。另外，整個酶解過程中在不同的時間段內(nèi)，同一氨基酸的釋放速率也有所差異，可能的原因是與酶作用基團(tuán)的特異性以及水解的隨機(jī)性有關(guān)。

表1 狼山雞肉蛋白酶解過程中產(chǎn)物的氨基酸組成分析Table 1 Free amino acid composition of chicken protein hydrolysates during enzymatic hydrolysis mg/100 mL

另外，整個酶解過程中游離氨基酸總量一直呈上升趨勢，從182.82 mg/100 mL上升到506.41 mg/100 mL，增長了約2.77 倍。在未酶解組中（0 h），游離氨基酸含量最多的是精氨酸、纈氨酸和賴氨酸，分別占總量的25.0%、12.0%、12.5%。根據(jù)文獻(xiàn)報道，Alcalase酶解雞肉蛋白的主要位點為丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，在酶解過程中此類氨基酸有明顯增長。在酶解過程中同樣有較多累計的游離氨基酸還有絲氨酸、谷氨酸和精氨酸，可能的原因是此類氨基酸為親水性氨基酸，在酶解過程中容易受到酶的作用從肽鏈中釋放。其中，在整個酶解過程中，增加最少的是半胱氨酸，其余氨基酸在整個酶解過程中都有較平穩(wěn)的增長，在酶解3～4 h過程中增加量明顯的減少，尤其是精氨酸和酪氨酸在此過程中出現(xiàn)了較小幅度的降低。主要是因為在實驗條件下溫度和pH值也有利于蛋白的合成，正是由于體系中底物濃度的升高造成合成類蛋白反應(yīng)的速率加快；另外，減少的氨基酸的另一個去向可能是參與了美拉德反應(yīng)，并產(chǎn)生大分子物質(zhì)并在離心過濾時被去掉。

2.2.4 Alcalase酶解雞肉蛋白產(chǎn)物價值評定

2.2.4.1 親水性氨基酸/疏水性氨基酸（hydrophilic amino acid/hydrophobic amino acid，HLAA/HBAA）變化

表2 狼山雞肉蛋白酶解過程中HLAA、HBAA含量分析Table 2 Contents of hydrophilic and hydrophobic amino acids released during enzymatic hydrolysis mg/100 mL

由表2可知，無論是親水氨基酸還是疏水氨基酸總量都有增加，在不同酶解時間產(chǎn)物中的HLAA/HBAA在1.41～1.52之間，差異較小，可能原因是Alcalase的酶作用特點決定了酶解產(chǎn)物中HLAA/HBAA值的波動。

2.2.4.2 營養(yǎng)價值評定

表3 狼山雞肉蛋白酶解產(chǎn)物營養(yǎng)評價Table 3 Nutritional evaluation of chicken meat hydrolysates

在酶解產(chǎn)物中甜味和鮮味氨基酸的含量變化對酶解雞肉蛋白產(chǎn)物的營養(yǎng)有著重要的作用。由表3可知，在酶解產(chǎn)物中各酶解時間都含有豐富的必需氨基酸，各必需氨基酸指數(shù)都與FAO/WHO推薦的成人理想氨基酸模式相接近，并且各時間段的氨基酸評分均高于水溶性提取物。在雞肉蛋白的酶解過程中必需氨基酸指數(shù)以及氨基酸分成不規(guī)則的變化趨勢，因此，可以通過對酶解雞肉蛋白的不同程度調(diào)節(jié)其營養(yǎng)價值。由于酶解作用的特點可以看出在不同的酶解過程中，0～3 h第一限制性氨基酸主要是含硫氨基酸，隨著酶解時間的延長，第一限制性氨基酸變?yōu)樘K氨酸，因此可以通過不同的酶解時間調(diào)節(jié)酶解產(chǎn)物的營養(yǎng)價值。

3 結(jié) 論

通過對狼山雞雞胸肉蛋白酶解條件的研究表明，酶解雞肉蛋白的最適酶解溫度為45 ℃、酶添加量為2.0 U/g、酶解時間為4 h。在酶解過程中雞肉蛋白的組分氮的存在形式表明，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白有較多的氨基酸釋放，并且可溶性氮也有大量的累積，對于基質(zhì)蛋白各種氮累積量較少。在酶解過程中，分子質(zhì)量大于90 kD的蛋白質(zhì)被大量分解，酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于35 kD的的蛋白不斷累積。酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要集中在30～50 kD之間。酶解雞肉蛋白產(chǎn)物的各種氨基酸呈現(xiàn)不規(guī)則的變化趨勢，丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸在酶解后期有下降的趨勢。在酶解產(chǎn)物中含量最高的氨基酸分別為天冬氨酸和谷氨酸。在酶解產(chǎn)物中親水性氨基酸（HLAA）與疏水性氨基酸（HBAA）比值在1.41～1.52之間。通過對酶解產(chǎn)物游離氨基酸的營養(yǎng)價值的分析，在不同酶解時間的酶解產(chǎn)物中含有豐富的必需氨基酸，該必需氨基酸指數(shù)與FAO/WHO推薦的成人理想氨基酸模式相類似。

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Regularity and Mechanism of Enzymatic Hydrolysis of Muscle Proteins from Langshan Chicken by Alcalase

LI Bin
(College of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

In this study, alcalase was applied to hydrolyze Langshan chicken breast meat. The results showed that the optimum temperature, enzyme dosage and hydrolysis time for enzymatic hydrolysis of chicken protein were 45 ℃, 2.0 U/g, and 4 h, respectively. Many amino acids derived from sarcoplasmic and myofibrillar proteins were released during enzymatic hydrolysis and soluble nitrogen was also accumulated in a large quantity. The molecular weights of peptides in the hydrolysate were mainly distributed in the range of 30-50 kD. Aspartic acid and glutamic acid were the most abundant amino acids in the hydrolysate with a ratio of hydrophilic amino acids (HLAA) to hydrophobic amino acids (HBAA) ranging from 1.41 to 1.52. The analysis of the nutritional value of free amino acids indicated the presence of abundant quantities of essential amino acids at different hydrolysis time and an essential amino acid index similar to the FAO/WHO recommended value from the ideal amino acid pattern for adults.

Langshan chicken; alcalase; proteolysis; amino acids

TS251.55

A

1002-6630（2015）21-0156-06

10.7506/spkx1002-6630-201521030

2015-01-15

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊支持計劃資助項目（13IRTSTHN006）

李斌（1981—），男，講師，碩士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：later@126.com