吳晨岑，范文來(lái)，徐巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無(wú)錫，214122)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)是一種廣泛存在于酒精飲料中的致癌物，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)歸類為2A類致癌物［1］。加拿大與巴西蒸餾酒中 EC 限量標(biāo)準(zhǔn)均為 150 μg/L［2-3］，我國(guó)尚未制定蒸餾酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)。

酒精飲料中EC的產(chǎn)生途徑主要有兩種:一是氰化物途徑，氰化物被氧化為氰酸鹽后與乙醇反應(yīng)形成EC［4-5］;二是尿素途徑，尿素在酸性條件下直接與乙醇反應(yīng)生成 EC［2，6］，或尿素?zé)岱纸猱a(chǎn)生的異氰酸和氰酸鹽與乙醇反應(yīng)形成EC［7］。針對(duì)這些產(chǎn)生機(jī)理，國(guó)外開(kāi)發(fā)了眾多降低酒精飲料中EC的方法，主要有:(1)原料預(yù)處理:如去除富含氰化物的果核［8］;(2)工藝控制:如烈酒避光貯存并縮短貯存時(shí)間［9］;控制發(fā)酵和貯存溫度［10］;分離酒尾并不再重蒸酒尾［11］;采用低溫和高回流率的蒸餾方法［2］;添加酸性脲酶以降低尿素含量［12］等;(3)改良微生物菌種:如選育低產(chǎn)尿素酵母，對(duì)釀酒酵母的基因進(jìn)行改造以降低其精氨酸酶活性，阻斷精氨酸代謝生成尿素途徑［13］;(4)高EC含量原酒處理方法:陰離子交換柱吸附EC前體物質(zhì)［14］;添加焦亞硫酸鉀作為一種抗氧化劑降低EC含量［15］等。世界各國(guó)蒸餾酒的生產(chǎn)大多采用液態(tài)壺式蒸餾，蒸餾二次或二次以上［16-18］;二次蒸餾能有效降低威士忌和甘蔗朗姆酒(cachaca)中 EC 的含量［6-17，19］。

我國(guó)白酒中EC的研究起步較晚，多集中在檢測(cè)方面［20-22］，而在白酒生產(chǎn)過(guò)程中如何降低EC含量的研究仍然處于空白。我國(guó)白酒因其固態(tài)發(fā)酵模式多采用甑桶蒸餾方式［23-24］，通常不進(jìn)行二次蒸餾。近期研究表明，濃香型原酒經(jīng)過(guò)壺式、常壓或減壓蒸餾后，感官品質(zhì)有所提升，原酒中的異嗅減輕，總酸濃度大幅度下降，總酯濃度下降差異較大，而酒體仍不失濃香型酒的主體風(fēng)格［25］。

本研究以濃香型新產(chǎn)原酒為研究對(duì)象，采用壺式、常壓及減壓蒸餾對(duì)濃香型原酒進(jìn)行二次蒸餾，研究了不同二次蒸餾方式、不同起始EC濃度等對(duì)EC去除率的影響，以及EC、氰化物和尿素在壺式蒸餾過(guò)程中的餾出規(guī)律，為白酒中EC含量的控制提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

濃香型原酒，由國(guó)內(nèi)某酒廠提供，2014年產(chǎn)，酒精度72.7%vol;氨基甲酸乙酯(EC，純度 ＞99%)、13C-尿素(99%，內(nèi)標(biāo))、N-叔丁基二甲基甲硅烷-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA，純度≥95%)、丁二酰亞胺、N-氯代丁二酰亞胺、吡啶、巴比妥酸、尿素、乙腈、二氯甲烷，色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司;氨基甲酸乙酯-d5(EC-d5，98%，內(nèi)標(biāo))、無(wú)水乙醇，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;NaCl、KCN，分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)。

銅制壺式蒸餾器7.5 L，葡萄牙Iberian Coppers S.A.;電子萬(wàn)用爐220 V/2 kW，楚水電熱電器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，孔義市予華儀器有限責(zé)任公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó) Millipore公司;GC 6890N-MSD 5975，美國(guó)Agilent公司;DB-FFAP色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;賽默飛TSQ 8000 Evo三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，TG-5MS 色譜柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;85 μm固相微萃取頭PA，美國(guó)Sigma-Aldrich公司;UV-2802紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 二次蒸餾方式

壺式蒸餾:參照文獻(xiàn)方法［25］，4.5 L低度酒(原酒加超純水稀釋至酒精度為28%vol或直接使用10～40%vol的初次蒸餾酒)裝入7.5 L銅壺，連接好鵝頸管和冷凝器。常溫自來(lái)水冷凝，電子萬(wàn)用爐加熱，采用二種蒸餾方式即慢火蒸餾(電爐調(diào)至500 W)和快火蒸餾(電爐調(diào)至1 500 W)。初餾液(初始低度酒體積的1.5%［19，26］)作為酒頭，酒頭之后到餾分酒精度為60%vol作為酒身，酒身之后到餾分酒精度為0%vol作為酒尾。關(guān)閉電爐，收集銅壺中的殘液。酒頭與酒尾可參與下一批二次蒸餾。酒身即為壺式蒸餾酒。

常壓蒸餾:參照文獻(xiàn)方法［25］，將300 mL低度酒倒入1 L燒瓶中，加入幾顆玻璃珠，連接好蛇形冷凝管與接收瓶。電子萬(wàn)用爐加熱，常溫自來(lái)水冷凝。酒頭、酒身和酒尾的掐取比例同壺式蒸餾，關(guān)閉電爐，收集燒瓶中殘液。酒身即為常壓蒸餾酒。

減壓蒸餾:參照文獻(xiàn)方法［25］，300 mL低度酒倒入1 L旋蒸瓶中。旋蒸加熱溫度40℃，真空表讀數(shù)-0.1MPa，常溫自來(lái)水冷凝。酒頭、酒身和酒尾的掐取比例同壺式蒸餾，關(guān)閉旋蒸儀，收集旋蒸瓶中的殘液。酒身即為減壓蒸餾酒。

1.2.2 頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)聯(lián)用技術(shù)定量EC

參照文獻(xiàn)方法［20］，取20 mL酒樣，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL，用超純水水洗旋蒸瓶3次定容至原體積(20 mL)，取8 mL置于20 mL頂空瓶中，加3 g NaCl飽和，添加8 μL 內(nèi)標(biāo) EC-d5(200 μg/L，最終濃度)，進(jìn)行HS-SPME。萃取條件:PA萃取頭，萃取溫度70℃，萃取時(shí)間45 min，250℃下解吸5 min。

GC條件:進(jìn)樣口溫度250℃，載氣 He，流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣，色譜柱為DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm，J＆W Scientific)。升溫程序:50 ℃保持2 min，以5℃/min的速度升溫至170℃，再以10℃/min的速度升溫至230℃，保持5 min。

MS條件:EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度為230℃，掃描范圍35～350 amu。采用選擇離子監(jiān)測(cè)(selected ion monitoring，SIM)模式，特征離子m/z 62、64分別用于EC和EC-d5定量。采用NIST05.L庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜分析。每個(gè)酒樣重復(fù)測(cè)定3次。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:以60%vol的酒精水溶液配制具有一定濃度梯度的EC標(biāo)準(zhǔn)液，按照與酒樣相同的處理方法進(jìn)GC-MS分析。以EC和EC-d5的峰面積之比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 吡啶-巴比妥酸比色法定量氰化物

參照文獻(xiàn)方法［27］，配制氧化劑(N-氯代丁二酰亞胺-丁二酰亞胺):1 g丁二酰亞胺溶于30 mL超純水中，再加入0.1 g N-氯代丁二酰亞胺并攪拌至溶解，加超純水定容至100 mL，4℃避光貯存;配制顯色劑(巴比妥酸-吡啶):將6 g巴比妥酸溶于少量水中，并加入30 mL吡啶，加超純水定容至100 mL，4℃避光貯存。

酒樣預(yù)處理:酒精度38%vol以上的酒樣加超純水或乙醇稀釋至46%vol，酒精度15% ～37%vol的酒樣加超純水或乙醇稀釋至30%vol，酒精度低于15%vol的酒樣不稀釋。取20 mL預(yù)處理后的酒樣，加入1 mL氧化劑和1 mL顯色劑，25℃下反應(yīng)25 min，于575 nm處測(cè)定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別以0、30%、46%vol的酒精水溶液配制具有一定濃度梯度的KCN標(biāo)準(zhǔn)液，按照與酒樣相同的處理方法進(jìn)行氰化物的測(cè)定。以吸光度為橫坐標(biāo)，KCN濃度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 衍生化結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)定量尿素

參照文獻(xiàn)方法［28］，取 100 μL 酒樣和 100 μL 內(nèi)標(biāo)13C-尿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于2 mL樣品瓶中氮吹吹干，加入50 μL二氯甲烷再次吹干，加50 μL MTBST-FA衍生劑和50 μL乙腈100℃反應(yīng)60 min后，進(jìn)樣檢測(cè)。

GC條件:進(jìn)樣口溫度250℃，載氣 He，流速1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣，色譜柱為TG-5MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm，Thermo Scientific)。升溫程序:50℃保持1 min，以20℃/min的速度升溫至170℃，保持5 min;以4℃/min的速度升溫至200℃，保持3 min;再以4℃/min的速度升溫至280℃，保持10 min。

MS條件:EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度300℃，掃描范圍40～300 amu，離子傳輸線溫度280℃。采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(selected reaction monitoring)模式，特征離子對(duì)m/z 231-147和m/z 232-147分別用于尿素和內(nèi)標(biāo)13C-尿素兩種物質(zhì)的定量。使用Nist 2011進(jìn)行質(zhì)譜分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制具有一定濃度梯度的尿素標(biāo)準(zhǔn)液，按照與酒樣相同的處理方法進(jìn)行尿素的測(cè)定。以尿素和C13-尿素的峰面積比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 EC去除率計(jì)算公式

式中:R1，EC絕對(duì)去除率，%;R2，EC 相對(duì)去除率，%;m0，原酒 EC質(zhì)量，μg;m1，二次蒸餾酒頭 EC質(zhì)量，μg;m2，二次蒸餾酒身 EC 質(zhì)量，μg;m3，二次蒸餾酒尾EC質(zhì)量，μg;m4，二次蒸餾殘液 EC質(zhì)量，μg;mc，二次蒸餾酒頭、酒身、酒尾及殘液中EC質(zhì)量之和，μg。其中 m0＜mc。

2 結(jié)果與討論

2.1 白酒中EC的定量

改進(jìn)史斌斌等［20］建立的測(cè)定方法，采用同位素氘標(biāo)記的EC-d5而非氨基甲酸丙酯作為內(nèi)標(biāo)，特征離子m/z 62、64分別用于EC和EC-d5的定量。該方法消除了氨基甲酸丙酯出峰處可能存在的干擾峰。由表1可知，該方法對(duì)目標(biāo)物質(zhì)具有較寬的線性范圍，線性關(guān)系良好(R2＞0.99)，檢測(cè)限(limit of detection，LOD)較低，能夠滿足白酒中EC定量分析的要求，向白酒樣品中添加相近濃度的EC標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得回收率在90% ～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.31% ～8.79%，該方法表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確性與精確性。

表1 白酒中EC定量方法的線性、檢測(cè)限、回收率及精密度(n=3)Table 1 Linearity，LOQ，recovery，and precision of the quantification of EC in Chinese liquor(n=3)

2.2 EC去除率

二次蒸餾是最常用的去除蒸餾酒中EC含量的方法［26］。本研究中的EC去除率有兩種定義:二次蒸餾后的酒相對(duì)于蒸餾前原酒中EC含量的降低百分比，即EC絕對(duì)去除率(R1);而參照甘蔗朗姆酒(cachaca)［19］和威士忌［6］的二次蒸餾時(shí)的EC降低百分比，即EC相對(duì)去除率(R2)。由于蒸餾過(guò)程的高溫［2］與銅的存在［6］促進(jìn)了EC的形成，二次蒸餾后酒頭、酒身、酒尾和殘液的EC總質(zhì)量較蒸餾前原酒上升了27.24% ～229.98%(表2)，所以每一種蒸餾方式的R1均低于R2。

表2 不同二次蒸餾方式對(duì)EC去除率的影響(n=3)Table 2 Influence of different types of double distillation in EC removal efficiency(n=3)

續(xù)表2

2.3 不同二次蒸餾方式對(duì)EC去除率的影響

本研究中測(cè)定的濃香型原酒中EC濃度為(233.33±7.21)μg/L，二次蒸餾后的酒中EC濃度下降至(43.57～94.77)μg/L，EC絕對(duì)去除率(R1)為71.07% ～86.70%，EC相對(duì)去除率(R2)高達(dá)81.46% ～92.76%(表2)。

快、慢火壺式蒸餾的R2均在90%以上，接近于甘蔗郎姆酒(cachaca)［19］二次蒸餾的EC去除率97%和威士忌［6］二次蒸餾的EC去除率98% ～99%。慢火壺式蒸餾總耗時(shí)(206 min)是快火(75 min)的2.7倍，慢火的R2(90.86%)稍低于快火(92.76%)，但從酒身EC濃度來(lái)看，慢火(75.23 μg/L)略低于快火(78.30 μg/L)，因此慢火的R1(77.05%)略高于快火(76.11%);而從EC增加百分比來(lái)看，快火(229.98%)明顯高于慢火(151.21%)，可能是因?yàn)榭旎鸬母邷卮偈剐纬闪烁嗟腅C，從而累積在酒尾及殘液中［2，19］?？傮w來(lái)講，快、慢火二次蒸餾對(duì)于白酒中EC的去除差異不大;而Almeida等［29］的研究表明快火二次蒸餾(55 min)的甘蔗朗姆酒中EC含量為39.2 μg/L，是慢火二次蒸餾(100 min)的1.84倍，其蒸餾采用燃燒甘蔗渣的直火式蒸餾，有別于本研究中采用的電爐加熱方式。

減壓蒸餾時(shí)的旋蒸加熱溫度控制在40℃，高沸點(diǎn)的EC很難被蒸出，減壓蒸餾能獲得EC濃度最低(43.57 μg/L)的二次蒸餾酒，R1為86.70%，高于其余任意一種二次蒸餾方式，EC增加百分比最低(27.24%);R2為89.55%，稍低于壺式蒸餾。然而近期研究表明，相對(duì)于壺式蒸餾和常壓蒸餾，減壓蒸餾的總酸、總酯含量降幅最大，分別下降90.20%、30.45%［25］。

常壓蒸餾的 EC去除率最低(R1，71.07%;R2，81.46%)，但從 EC增加百分比來(lái)看，常壓蒸餾(56.06%)明顯低于壺式蒸餾，推測(cè)壺式蒸餾時(shí)銅的存在對(duì)EC的形成有一定影響［4］。

2.4 不同起始EC濃度原酒對(duì)EC去除率的影響

向1 731.2 mL濃香型原酒(EC濃度，233.33±7.21 μg/L)中分別添加 31、82 μL 的 EC 標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度20 316 mg/L)配制成EC濃度為597.12 μg/L和1 195.62 μg/L的原酒(表3)，對(duì)中、高EC濃度原酒進(jìn)行快火壺式蒸餾。結(jié)合表3中的未添加EC標(biāo)準(zhǔn)品的快火壺式蒸餾(對(duì)照組)，從酒身來(lái)看，不同起始EC濃度濃香型原酒經(jīng)壺式蒸餾后的酒身中EC濃度并非一致，其濃度范圍在78.30～219.91 μg/L;而從EC去除率來(lái)看，3種EC濃度原酒的R1在76.11%～87.64%，R2在89.91% ～92.76%，高沸點(diǎn)的EC主要集中在酒尾及殘液中。所以，壺式蒸餾能有效去除原酒中EC的含量，對(duì)不同EC濃度的原酒均能達(dá)到較好的EC去除效果。

表3 不同起始EC濃度濃香型原酒對(duì)EC去除率的影響(n=3)Table 3 Influence of different concentration of EC in strong aroma type base liquor in EC removal efficiency(n=3)

2.5 濃香型原酒壺式蒸餾過(guò)程中EC、尿素和氰化物的變化

快火壺式蒸餾時(shí)，隨著酒精度的下降，EC濃度呈現(xiàn)先下降后平穩(wěn)再上升的趨勢(shì)(圖1)。這與甘蔗郎姆酒(cachaca)［19］和威士忌［6］二次蒸餾過(guò)程中 EC 的餾出規(guī)律類似。

圖1 濃香型原酒快火壺式蒸餾過(guò)程中酒精度、EC、氰化物和尿素的變化Fig.1 Ethanol，EC，cyanide，and urea concentrations during fast pot still distillation of strong aroma type liquor

蒸餾過(guò)程中，酒可以看作是酒精與水的共沸混合物，其沸點(diǎn)低于100℃，低于EC的沸點(diǎn)186℃，但并不能阻止EC被蒸餾到酒中［30］，整個(gè)蒸餾過(guò)程中均能檢測(cè)到EC。EC在乙醇中的溶解度(1.2 g/mL)高于水中的溶解度(0.1 g/mL)［31］，并且5 min前的初餾分中含有大量氰化物(1 375.20 μg/L)，可能與乙醇反應(yīng)形成EC［3］，因而初餾分中有較高含量的 EC(251.67 μg/L)，二次蒸餾有必要掐去酒頭。

在蒸餾的5～20 min內(nèi)，餾分酒的酒精度由74.1%vol下降至70.7%vol，蒸氣溫度從65℃上升至84.5℃，餾分酒中EC含量呈明顯的下降趨勢(shì)，在第25 min尿素含量出現(xiàn)峰值(289.47 μg/L)，而 EC濃度仍維持在較低水平。推測(cè)在蒸餾過(guò)程前期，EC主要來(lái)源于酒中本身存在的EC。

當(dāng)餾分酒精度達(dá)到61.3%vol時(shí)，酒身接取完畢，酒尾開(kāi)始蒸出，餾分酒中EC含量迅速增加，氰化物含量不斷下降，而尿素含量先下降后至40 min開(kāi)始與EC同步波動(dòng)增長(zhǎng)。隨著蒸餾過(guò)程的進(jìn)行，共沸混合物因酒精濃度下降而沸點(diǎn)逐漸升高，蒸氣溫度從88℃不斷上升至99℃，推測(cè)因高溫酒中微克/升級(jí)的尿素和氰化物會(huì)加速與乙醇的反應(yīng)，生成更多的EC［2］，從蒸餾后期氰化物下降與尿素上升的變化趨勢(shì)來(lái)看，氰化物可能是蒸餾后期形成EC的主要前體。當(dāng)餾分酒精度降至0%vol時(shí)，酒尾接取完畢，蒸餾過(guò)程結(jié)束，最終餾分的EC濃度達(dá)到整個(gè)蒸餾過(guò)程的最高值258.89 μg/L?？梢?jiàn)EC大量存在于61.3%vol以下的酒尾中，二次蒸餾的掐頭去尾工藝能有效降低白酒中EC的含量。

3 結(jié)論

采用壺式、常壓及減壓蒸餾對(duì)降度的濃香型原酒進(jìn)行二次蒸餾，研究不同二次蒸餾方式對(duì)EC去除率的影響，發(fā)現(xiàn)壺式蒸餾時(shí)的 EC相對(duì)去除率最高(92.76%)，其次是減壓蒸餾、常壓蒸餾。采用適當(dāng)?shù)钠^去尾方法能夠獲得EC濃度(43.57～113.04 μg/L)較原酒(233.33 μg/L)低得多的二次蒸餾酒。EC大量富集在酒尾及殘液中。慢火壺式蒸餾酒的EC濃度略低于快火壺式蒸餾，快、慢火壺式蒸餾對(duì)EC的去除無(wú)明顯差異。二次蒸餾對(duì)不同EC濃度(233.33～1 162.94 μg/L)的原酒均能達(dá)到較佳的EC去除效果，絕對(duì)去除率為76.11% ～87.64%，EC相對(duì)去除率在89.91%～92.76%。減壓蒸餾能獲得最低EC濃度的二次蒸餾酒，這將在以后進(jìn)一步研究。壺式蒸餾過(guò)程中EC濃度隨著酒精度的降低而呈現(xiàn)先下降后平穩(wěn)再上升的趨勢(shì)，二次蒸餾掐頭去尾工藝能有效降低白酒中EC的含量，蒸餾過(guò)程前期的EC主要來(lái)源于酒中本來(lái)存在的EC，而蒸餾過(guò)程后期的EC可能主要來(lái)自于氰化物等前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，后續(xù)將做進(jìn)一步的深入研究。

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