SEA聯(lián)合熱療對(duì)Hep-2細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制

鞠洋許承弼江昌劉學(xué)識(shí)博杰辛丁

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130041)

摘要〔〕目的探討體外葡萄球菌腸毒素A(SEA)聯(lián)合熱療對(duì)人喉癌細(xì)胞株(Hep-2株)生長(zhǎng)、增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響。方法應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)不同條件下對(duì)Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程的變化及凋亡率，透射電子顯微鏡檢測(cè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果單純熱療組、單純SEA組及聯(lián)合組(SEA+熱療)對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖抑制率分別 16.5%、25%和45.4%，與對(duì)照組相比差別有顯著意義；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，且細(xì)胞凋亡率升高，組間比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論SEA聯(lián)合熱療能顯著提高Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率，抑制G1期細(xì)胞向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)程，誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。

關(guān)鍵詞〔〕人喉頭癌細(xì)胞株；葡萄糖菌腸毒素A；熱療；細(xì)胞周期；凋亡

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R739.4〔

通訊作者：辛丁(1963-)，男，教授，主要從事耳鼻咽喉頭頸腫瘤研究。

第一作者：鞠洋(1989-)，女，在讀碩士，主要從事耳鼻咽喉頭頸腫瘤研究。

手術(shù)及全身化療是目前喉癌治療的主要手段，但是多藥耐藥的產(chǎn)生嚴(yán)重影響化療效果及預(yù)后，是臨床亟待解決的問(wèn)題〔1〕。因此，嘗試新的治療方法，防止多藥耐藥的產(chǎn)生，對(duì)提高喉癌的治療效果及生存率有重要意義。本研究應(yīng)用超抗原葡萄糖菌腸毒素A(SEA)聯(lián)合熱療觀察其對(duì)喉頭癌細(xì)胞株Hep-2生物學(xué)行為的影響，旨在為喉癌的生物治療提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料Hep-2細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈(zèng)，(MTT)試劑及RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，SEA由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；胎牛血清購(gòu)于長(zhǎng)春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml,接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，100 μl/孔，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到80%匯合時(shí)進(jìn)行分組，單純熱療組43℃±0.2℃持續(xù)加熱40 min，然后移入37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)；單純SEA組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果SEA最適量為40 ng/ml，聯(lián)合組在單純SEA組基礎(chǔ)上再加熱43℃±0.2℃ 40 min，然后移入5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)2 h，于結(jié)束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸棄上清加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩10 min,使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔吸光度A值，按下列公式計(jì)算Hep-2細(xì)胞增殖抑制率。Hep-2細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞A值÷對(duì)照孔細(xì)胞A值)×100%

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進(jìn)行，培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，70%冷乙醇固定，上機(jī)前過(guò)40目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106/ml，碘化吖啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞周期結(jié)果以Modiff 2.0軟件分析。

1.2.3透射電子顯微鏡技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2.2，收集不同條件下作用的Hep-2細(xì)胞，移入錐型離心管內(nèi)，離心棄上清，應(yīng)用2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0軟件行t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MTT結(jié)果不同條件下對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖均有抑制作用，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，但聯(lián)合組效果明顯，兩者合用有協(xié)同作用。見(jiàn)表1。

組別A值抑制率(%)P值對(duì)照組1.52±0.12--熱療組1.27±0.1316.5<0.01SEA組1.14±0.1925.0<0.01聯(lián)合組0.83±0.1745.4<0.01

2.2流式細(xì)胞術(shù)不同條件對(duì)Hep-2細(xì)胞周期各時(shí)相的影響G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期相對(duì)增多，細(xì)胞凋亡率升高，組間比較差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別G0/G1SG2/M凋亡率對(duì)照組29.4±2.664.2±3.56.4±1.22.0熱療組42.7±3.41)38.7±4.11)18.6±2.41)9.21)SEA組48.4±5.11)32.2±3.31)19.4±1.71)13.41)聯(lián)合組58.5±3.41)19.6±4.41)21.9±2.41)19.51)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.3透射電子顯微鏡結(jié)果單純熱療組Hep-2細(xì)胞超微結(jié)細(xì)胞膜破裂，有空泡形成，細(xì)胞高度空化，聯(lián)合組細(xì)胞核染色質(zhì)趨邊凝集，可見(jiàn)凋亡小體。見(jiàn)圖1。

熱療組

SEA組

聯(lián)合組

圖1電子顯微鏡下Hep-2細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變(×5 000)3討論

腫瘤熱療被稱為是繼手術(shù)、放療、化療和生物治療后的第5種腫瘤治療方法〔2〕。熱療不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒效應(yīng)，而且還可以增強(qiáng)放療化療的療效，提高機(jī)體的免疫力，因而被國(guó)際抗癌組織稱之為“腫瘤綠色療法”。MTT實(shí)驗(yàn)可準(zhǔn)確反映活細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活化狀態(tài)。因此被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究，具有一定的客觀性。

文獻(xiàn)報(bào)道〔3〕，熱療可改變細(xì)胞周期的兩個(gè)調(diào)控點(diǎn)，一個(gè)位于G1-S轉(zhuǎn)折點(diǎn)，控制細(xì)胞生長(zhǎng)前期(DNA合成期)，另一個(gè)調(diào)控點(diǎn)位于G2/M期轉(zhuǎn)折點(diǎn)，是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)。結(jié)果顯示，熱療可抑制G1期細(xì)胞向S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而使G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，造成G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反映〔4〕，這一點(diǎn)從細(xì)胞凋亡率上得到證實(shí)。SEA是一組對(duì)熱穩(wěn)定的可溶性蛋白質(zhì)，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常見(jiàn)病因〔5〕。SEA殺傷腫瘤有兩種途徑：一是直接細(xì)胞毒效應(yīng)，二是間接殺傷腫瘤細(xì)胞，不需加工直接與(MHC)Ⅱ類(lèi)分子形成配體，通過(guò)配體抑制細(xì)胞的增殖，由于SEA對(duì)熱穩(wěn)定，所以聯(lián)合熱療應(yīng)用優(yōu)于化學(xué)藥物。

綜上所述，SEA具有直接的細(xì)胞毒效應(yīng)，尤其是喉癌屬于腔內(nèi)淺表腫瘤，應(yīng)用SEA可直接腔內(nèi)灌注或瘤體內(nèi)注射，避免全身使用毒副作用的產(chǎn)生。因此，SEA聯(lián)合熱療用于喉癌的治療有廣闊前景。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-10-07修回〕

(編輯袁左鳴)