金花茶對(duì)衰老大鼠的抗氧化和抗凋亡作用

盧春毅劉紅楊曦榮曦黃李平1黃振光2

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年內(nèi)分泌科，廣西南寧530022)

摘要〔〕目的探討金花茶對(duì)亞急性衰老大鼠抗氧化和抗凋亡的作用。方法擬建立大鼠亞急性衰老模型后，予高、低濃度金花茶灌胃干預(yù)。測(cè)肝臟和睪丸組織超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)含量及bax、bcl-2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與衰老模型組對(duì)比，高、低濃度金花茶組肝臟和睪丸組織SOD含量和bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且MDA含量和bax mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)。高、低濃度金花茶組間比較，上述指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)結(jié)論金花茶可以提高SOD含量和降低MDA含量，通過(guò)上調(diào)bcl-2和下調(diào)bax表達(dá)水平，減慢肝臟和睪丸細(xì)胞的凋亡，對(duì)延緩機(jī)體衰老有重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕金花茶；衰老；凋亡；抗氧化

中圖分類號(hào)〔〕R5〔

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(g22c1055)

通訊作者：劉紅(1960-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌代謝病研究。

1中醫(yī)科2藥劑科

第一作者：盧春毅(1986-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌代謝性疾病研究。

研究證實(shí)，茶中總游離氨基酸為80.8 mg/100 g,脯氨酸占總游離氨基酸的38.7%〔1〕；黃酮類物質(zhì)、茶多酚〔2〕和皂甙的含量分別為8.5%、4.42%和7.0%,維生素C和維生素E的含量分別為90 mg/100 g和520 mg/100 g。金花茶中營(yíng)養(yǎng)豐富且富含多種延緩衰老作用的成分。本實(shí)驗(yàn)觀察金花茶對(duì)大鼠自由基和凋亡因子表達(dá)水平的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器和試劑D-半乳糖(博仁生物)；金花茶(廣西桂人堂圓茶：多酚類物質(zhì)含量極高的金花茶鮮嫩葉精制而成)；丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DEPC(焦碳酸二乙酯)(美國(guó)AMRESCO公司)；DNA Marker(上海生工)；PCR引物(上海生工)；Tag DNA聚合酶(Ptomega公司)；高速低溫離心機(jī)(Beckman產(chǎn)品)；紫外分光光度計(jì)(上海長(zhǎng)明光學(xué)電子儀廠)；PCR擴(kuò)增儀(Gene Amp PCR system)；電泳槽(北京東方特力科貿(mào)中心)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠(180～220 g)40只，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級(jí)飼養(yǎng)，普食。

1.3動(dòng)物分組和處理隨機(jī)分成正常對(duì)照組、衰老模型組、低濃度金花茶組和高濃度金花茶組，每組10只。衰老模型組和金花茶組采用D-半乳糖連續(xù)腹腔注射200 mg·kg-1·d-1制備亞急性衰老動(dòng)物模型，1次/d,共40 d。衰老模型組造模成功后不再做任何處理。金花茶組大鼠造模成功后，低、高農(nóng)度組大鼠分別每天用金茶花2、4 g/kg煮水灌胃，1次/d，共40 d。正常對(duì)照組大鼠每天灌胃同等劑量的生理鹽水，時(shí)間同金花茶組大鼠。所有大鼠最后1次灌胃后全部斷頸處死取肝臟和睪丸組織測(cè)衰老指標(biāo)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝臟和睪丸組織SOD，MDA。肝臟和睪丸組織bcl-2和bax的RNA檢測(cè)：根據(jù)GeneBank發(fā)表的大鼠基因序列，由上海生工設(shè)計(jì)并合成引物(見表1)。取肝臟和睪丸組織，用總RNA試劑盒提取組織RNA，依次進(jìn)行RNA檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃ 3 min,95℃ 1 min，58℃(bax)30 s/59℃(bcl-2)30 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min,4℃終止反應(yīng)，電泳成象及分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析和q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1金花茶對(duì)衰老大鼠肝臟和睪丸SOD和MDA含量的影響在肝臟和睪丸組織中，與正常對(duì)照組相比，衰老模型組MDA含量均明顯增多(P<0.05),且SOD活性均降低(P<0.05)；與衰

老模型組相比，高、低濃度金花茶組MDA含量均明顯降低，且SOD含量均增高(P均<0.05)，高、低濃度組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。此結(jié)果說(shuō)明金花茶能降低衰老機(jī)體MDA含量并提高SOD活性，具有抗氧化作用，且高濃度時(shí)作用較強(qiáng)。見表2。

2.2金花茶對(duì)衰老大鼠肝臟和睪丸bcl-2 bax mRNA表達(dá)的影響在肝臟和睪丸組織中，衰老模型組大鼠肝組織中bax表達(dá)均增高，bcl-2表達(dá)均降低，與正常對(duì)照組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)；與衰老模型組相比，高、低濃度金花茶組bax表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，bcl-2表達(dá)均明顯增高(P<0.05)，高、低濃度組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。由此可知金花茶能抑制衰老大鼠肝臟和睪丸組織細(xì)胞凋亡，高濃度時(shí)抑制作用較強(qiáng)。見表2。

表1RT-PCR引物設(shè)計(jì)及合成程序

基因引物序列RCP產(chǎn)物長(zhǎng)度bax上游:5'CTAGCAAACTGGTGCTCAAGG3'178bp下游:5'GATGGTCACTGTCTGCCATGT3'bcl-2上游:5'GATTGTGGCCTTCTTTGAGTTC3'111bp下游:5'CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC3'

組別肝臟MDA SOD睪丸MDA SOD肝臟bcl-2mRNA baxmRNA睪丸bcl-2mRNA baxmRNA正常對(duì)照組3.75±0.65357.93±46.062.86±0.24277.94±26.300.821±0.1400.272±0.0220.564±0.0350.183±0.126衰老模型組6.84±0.281)211.68±30.691)6.01±0.451)181.20±19.811)0.296±0.0251)0.865±0.1891)0.189±0.0291)0.608±0.0291)低濃度金花茶組4.99±0.192)265.44±23.482)4.99±0.192)220.98±26.422)0.424±0.0152)0.418±0.0352)0.361±0.0232)0.350±0.0142)高濃度金花茶組5.59±0.382)3)296.57±24.542)3)4.51±0.332)3)253.76±13.472)3)0.502±0.0162)3)0.309±0.0052)3)0.461±0.0102)3)0.440±0.0102)3)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與衰老模型組比較：2)P<0.05；與低濃度金花茶組比較：3)P<0.05

3討論

當(dāng)生物體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，抗氧化酶SOD活性降低，過(guò)氧化物MDA堆積，直接損害或者通過(guò)一系列過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引起蛋白質(zhì)變性和核酸破壞，導(dǎo)致線粒體等廣泛的生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)破功能受損，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，引起機(jī)體衰老〔3〕。本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)D-半乳糖腹腔注射，衰老模型組大鼠睪丸和肝臟組織中氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下降而bax mRNA表達(dá)升高，相比正常對(duì)照組睪丸和肝細(xì)胞凋亡增加。

衰老與性腺的功能退化和性激素水平的降低密切相關(guān)〔4〕。睪酮主要由睪丸細(xì)胞分泌，并且與睪丸組織SOD活性正相關(guān)〔5〕，由于增齡過(guò)程中氧化應(yīng)激的作用和睪丸細(xì)胞的不斷凋亡，致使睪丸細(xì)胞功能受損減低，可能導(dǎo)致血清睪酮水平的下降使衰老程度加重。此外，肝臟作為性激素代謝的重要器官，自由基損傷及肝細(xì)胞凋亡使肝臟代謝睪酮等性激素能力下降〔6〕，未代謝性激素過(guò)多殘留可能通過(guò)負(fù)反饋抑制，導(dǎo)致體內(nèi)性激素分泌減少加快衰老。

本文結(jié)果表明，金花茶一方面可能通過(guò)對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化，平衡機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)延緩衰老；另一方面可能通過(guò)抑制睪丸和肝臟組織細(xì)胞凋亡，以提高睪丸和肝臟組織維持機(jī)體性激素水平的能力，協(xié)調(diào)睪丸和肝臟功能，多位點(diǎn)加強(qiáng)機(jī)體抗衰老作用。機(jī)體的衰老可能與睪丸和肝臟的功能下降失調(diào)有關(guān)，但其發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，金花茶延緩衰老的作用機(jī)制也還需進(jìn)一步研究探討。

4參考文獻(xiàn)

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6洪美珠，陳國(guó)良.肝硬化與睪酮、雌二醇相互作用關(guān)系研究現(xiàn)狀〔J〕.世界華人消化雜志，2006；14(35)：3397-401.

〔2012-12-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)