王宏歸，黃 晨，姜 雅，嚴(yán)秋香，周春洪

(1.揚州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州225127;2.揚州大學(xué)測試中心，江蘇揚州225009)

常見的誘導(dǎo)型載體有四環(huán)素類、糖皮質(zhì)激素類、雌激素類、酒精類、蛻皮(Ecdysone)激素類、金屬類。這些類型的誘導(dǎo)載體各有優(yōu)劣。四環(huán)素誘導(dǎo)型載體，其四環(huán)素使用量大，不僅對細(xì)胞產(chǎn)生毒害，而且對環(huán)境也會造成危害;雌激素誘導(dǎo)型載體，由于雌激素在植物體內(nèi)不易擴散，局部誘導(dǎo)性強，因此不適宜對整株植物誘導(dǎo);蛻皮激素誘導(dǎo)型載體，其缺點是葉片對蛻皮激素吸收差;酒精誘導(dǎo)型載體，其缺點:酒精對植物有毒害作用，且易揮發(fā);銅誘導(dǎo)型載體，誘導(dǎo)素元銅對細(xì)胞有毒害作用，且其擴散有限;地塞米松是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型表達(dá)載體的誘導(dǎo)劑，不僅無毒，而且可以高效地被運輸?shù)街参锏母鱾€組織。

正因為地塞米松具有以上優(yōu)點，所以糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型表達(dá)載體適合用于植物轉(zhuǎn)基因。目前研究大部分都是將GR-Cre重組酶片段和Loxp位點分別構(gòu)建在2個Ti質(zhì)粒的T-DNA上，要實現(xiàn)Loxp位點的重組，必須將2個質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植株進行雜交，如果將GR-Cre重組酶片段和Loxp位點同時構(gòu)建在同一個載體上，那么Loxp位點的重組無需通過雜交，這樣既可以節(jié)省時間也可以減少工作量［1－3］。

由于重組酶能使Loxp位點的DNA發(fā)生重組，而DNA位于細(xì)胞核內(nèi)，因此，Gre只能在細(xì)胞核內(nèi)起作用。Cre與GR的融合蛋白，在不外加地塞米松時，GR-Cre通過GR結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，DNA重組不能發(fā)生;當(dāng)有地塞米松時，GR-Cre通過GR與地塞米松結(jié)合，使得GR-Cre從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫落，進入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到Loxp位點上，引發(fā)重組［4－5］。在Loxp位點之間還含有一個Gateway cassette和多克隆位點(MCS)，Gateway克隆技術(shù)的優(yōu)點是不受酶切位點的限制，該載體的Gateway cassette含有attR1和attR2兩個重組位點，這個位點用于克隆不同的啟動子，而多克隆位點(MCS)位于Gateway cassette的后面，用于目的基因的克隆［6］。位于loxP位點之間的DNA，將在外加地塞米松的情況下，引發(fā)DNA重組而被敲除［7－11］。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所用菌株是DH5α 與DB3.1，DB3.1用于進行克隆或者擴繁含有Gateway片段的質(zhì)粒［6］。質(zhì)粒是pJawoh18-RNAi、pCre、pUC57。限制性內(nèi)切酶及 T4DNA 連接酶均購自于NEB公司。PCR引物由primer5設(shè)計，PrimerSTAR TM HS Polymerase購自于TaKaRa公司。試驗中使用的引物:GR-Cre F:CGGGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACAC，R:CGG CCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT，2 059 bp;GatewayF:CGGCGTACGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCT GA，CassetteR:CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAG CTG1，1 706 bp。

1.2 方法 PCR反應(yīng)體系:模板DNA 0.5 μl，正反向引物(10 μmol/L)各 1 μl，10 × buffer 5 μl，dNTPs(10 mmol/μl)5 μl，DNA 聚合酶 0.5 U，加水補齊 50 μl。酶切體系:DNA 1 μg，buffer 2 μl，內(nèi)切酶各加1 U，加水補齊20 μl，37 ℃酶切過夜，連接體系:載體:目的片段為 1∶3～1∶9，T4連接酶 1 U，buffer 2 μl，加水補齊 20 μl，4 ℃連接過夜。

2 結(jié)果與分析

2.1 Loxp-nos-Loxp(XhoI-SofI-Loxp-NheI-NcoI-NOS-BsiwI-KpnI-StuI-BgIII-MfeI-AatII-1xMyc-Loxp-SpeI)片段的合成 Loxp-nos-Loxp(南京金斯瑞生物科技公司合成)是以XhoI及SpeI位點克隆在pUC57載體上。該片段含有2個同向Loxp位點，NOS終止信號序列位于NcoI與BsiwI位點之間。Myc標(biāo)簽用于蛋白表達(dá)檢測，多克隆位點用于克隆基因(圖1)。

2.2 工程質(zhì)粒的構(gòu)建 以pJawoh18-RNAi二元載體為骨架，利用XhoI及SpeI酶切位點將Loxp-nos-Loxp克隆到pJawoh18-RNAi載體上，即pElrL載體(圖2)。利用GR-Cre的引物從pCre載體［12－13］上擴增 GR-Cre片段，再利用 NheI與NcoI酶切位點，將GR-Cre克隆到pElrL載體上，即pElrLC載體(圖2)。將Gateway擴增片段，經(jīng)BsiwI與KpnI酶切后并回收，并克隆至pElrLC上，即pElrLCG載體(圖2)。

3 討論

Cre是從噬菌體P1分離出來的DNA特異位點重組酶。Loxp位點是Cre識別位點，其最早也是在P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)。loxP在兩端有13個反向重復(fù)的堿基，中間核心序列是8個非回文結(jié)構(gòu)的堿基，共34個堿基。Cre重組酶識別并結(jié)合在loxP位點的兩端，并從中間核心序列區(qū)將loxP切開。2個同向的loxP位點，在重組酶的作用下將2個loxP切開從而產(chǎn)生4個黏性末端，loxP位點之間的序列會自我連接成環(huán)，從而從基因組中環(huán)出丟失。

pElrLCG該載體的優(yōu)點:①地塞米松作為誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)對植物無毒害作用，而且可以高效地被運輸?shù)街参锏母鱾€組。②該載體可以同時使用Gateway克隆技術(shù)以及常規(guī)酶切連接克隆技術(shù)。③GR-Cre重組酶表達(dá)后，可以通過是否施加地塞米松來控制Cre的入核，從而人為控制何時把轉(zhuǎn)入的基因從基因組中刪除掉。④該載體在雜交育種中也有很大潛力，如花粉不育的性狀優(yōu)良的母本，利用含有目的基因的載體即可得到花粉可育(轉(zhuǎn)基因)和花粉不育(轉(zhuǎn)入的目的基因環(huán)出丟失)的植株，這樣花粉可育的植株可以用來繁殖種子，而花粉不育的植株可以用作雜交育種的母本。⑤該載體的Myc標(biāo)簽可以用于檢測轉(zhuǎn)入的基因是否表達(dá)。⑥該載體在施加地塞米松誘導(dǎo)后，GR-Cre進入核引發(fā)Loxp位點重組，Loxp位點之間的DNA片段從基因組里環(huán)出，由于環(huán)出的DNA片段包含了GR-Cre以及轉(zhuǎn)入的基因，而又不含有啟動子與3'末端加尾信號。因此，只要Loxp位點重組發(fā)生，GR-Cre及目的基因的轉(zhuǎn)錄即終止?？傊?，該載體在實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，可以選擇性地關(guān)閉/刪除目的基因。

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