蔡瑤俊，查小雪，寧 丹，王 囡，賈雪梅，朱德發(fā)

甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠額葉乙酰膽堿、munc-18的影響

蔡瑤俊1，查小雪1，寧 丹1，王 囡1，賈雪梅2，朱德發(fā)

目的觀察甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥（簡稱甲減）大鼠額葉內乙酰膽堿含量以及munc-18表達的影響，探討甲減腦額葉損傷及恢復的可能分子機制。方法采用給予含0.05%丙基硫氧嘧啶的飲用水6周建立大鼠甲減模型。自第5周起，給予多奈哌齊、甲狀腺素或甲狀腺素聯合多奈哌齊治療2周，采用放射免疫法檢測血清甲狀腺激素水平，堿性羥胺比色法測定額葉內乙酰膽堿含量，免疫組化法檢測額葉內munc-18的分布與表達。結果甲減組、多奈哌齊治療組大鼠血清三碘甲狀腺原氨酸（T3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）水平顯著減低、促甲狀腺激素（TSH）水平明顯增加（P＜0.01），甲狀腺素治療組、聯合治療組T3、T4、TSH水平與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義；甲減組大鼠額葉內乙酰膽堿含量下降（P＜0.05），多奈哌齊治療組、甲狀腺素治療組、聯合治療組乙酰膽堿含量均恢復至正常水平，其中聯合治療組有進一步恢復趨勢；甲減組、多奈哌齊治療組大鼠munc-18在額葉內Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層表達下降（P＜0.05）。其中，以Ⅲ／Ⅴ層下降最為顯著（P＜0.01），甲狀腺素治療組munc-18表達仍下降（P＜0.05），聯合治療組額葉內munc-18表達正常。結論多奈哌齊可以改善甲狀腺功能減退引起的額葉內乙酰膽堿含量改變；甲狀腺素聯合多奈哌齊治療有利于成年期甲狀腺功能減退造成的額葉內膽堿含量改變和突觸蛋白損傷的恢復。

甲狀腺功能減退癥；額葉；乙酰膽堿；munc-18；左旋甲狀腺素；多奈哌齊

成年期甲狀腺功能減退癥（簡稱甲減）可引起腦部額葉損害，額葉皮質是對學習記憶很重要的腦部結構［1－2］。研究［3－4］表明甲減可以損傷額葉內突觸相關蛋白的表達及膽堿能系統(tǒng)。腦內乙酰膽堿是中樞神經系統(tǒng)最重要的神經遞質之一，在其釋放過程中有多種突觸相關蛋白的參與。munc-18是一種突觸前膜胞內蛋白，參與乙酰膽堿的釋放［5］，在突觸囊泡“胞外排”方式分泌神經遞質過程中起重要作用［6］。研究［3］表明甲減大鼠生理劑量的甲狀腺素替代治療后，腦內突觸相關蛋白的損傷未完全恢復。多奈哌齊作為一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，在改善認知功能以及神經保護方面起重要作用［7］。該研究旨在觀察成年期甲減大鼠額葉內乙酰膽堿含量、munc-18表達變化以及探討甲狀腺素聯合多奈哌齊治療的恢復效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只健康成年雄性SD大鼠，普通級，體重260～300 g，購自南京實驗動物中心。常規(guī)條件下喂養(yǎng)，自然采光，自由接受標準鋸齒類動物食物以及飲水。實驗遵循《安徽醫(yī)科大學實驗用動物管理和使用指南》。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 儀器 DXM1200F光學顯微鏡（日本Nikon公司）；DFM296型16管放射免疫計數器（合肥眾成機電技術開發(fā)有限公司）；JEDR 801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達科技發(fā)展有限公司）；酶標儀（美國Biote儀器有限公司）。

1.2.2 試劑 丙基硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）、左旋甲狀腺素（levothyrocine，L-T4）、多奈哌齊（美國Sigma公司）；三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲狀腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）放射免疫試劑盒（北京北方生物技術研究所）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；DAB染色試劑盒、SP-0022生物素標記羊抗兔IgG SP超敏試劑盒（北京博奧森公司）；抗munc-18蛋白多克隆抗體（美國BD公司）。

1.3 動物模型建立大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨后將其隨機均分為5組：正常對照組、甲減組、多奈哌齊治療組、甲狀腺素治療組、聯合治療組。正常對照組自由飲水，余下4組給予含0.05%PTU飲用水6周制備甲減模型。第5周起，多奈哌齊治療組每日在

飲用水中加0.005%多奈哌齊，甲狀腺素治療組每日腹腔注射給予L-T4 6 μg／100 g體重，聯合治療組每日予飲用水中加入0.005%多奈哌齊以及腹腔注射L-T4 6 μg／100 g體重。同時，正常對照組、甲減組、多奈哌齊治療組每日腹腔注射給予等量的無菌生理鹽水。各組大鼠每周稱重1次，根據體重調整給藥劑量，治療時間2周。

1.4 標本制備腹主動脈采血待測T3、T4、TSH。取血后將大鼠斷頭處死，于冰臺迅速取分離大腦額葉部位組織，左側額葉放置于－80℃冰箱儲存待測乙酰膽堿含量，右側額葉浸泡于4%的多聚甲醛溶液中固定待做免疫組化。

1.5 甲狀腺激素水平測定血清T3、T4、TSH采用放射免疫法測定，嚴格按照放射免疫試劑盒說明書操作。

1.6 乙酰膽堿含量測定采用堿性羥胺比色法測定額葉內乙酰膽堿含量，根據BCA試劑盒操作步驟進行測定。

1.7 免疫組化染色超敏SP法行免疫組化法檢測。應用光學顯微鏡分別拍攝額葉各層：分子層（Ⅰ層）、外顆粒層（Ⅱ層）、外錐體細胞層（Ⅲ層）、內顆粒層（Ⅳ層）、內椎體細胞層（Ⅴ層），隨后應用形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)分析Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層munc-18的免疫反應產物的光密度值，取其平均光密度值（average optical density，AOD）。

1.8 統(tǒng)計學處理應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步分析采用LSD法進行多重比較。

2 結果

2.1 各組大鼠血清甲狀腺激素水平與正常對照組相比，甲減組、多奈哌齊治療組的大鼠血清T3、T4水平均顯著減低、TSH水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（F＝5.14、33.84、24.40，P＜0.01）；甲狀腺素治療組、聯合治療組血清T3、T4、TSH與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 各組大鼠額葉中乙酰膽堿含量與正常對照組相比，甲減組大鼠額葉內乙酰膽堿含量明顯降低（F＝2.71，P＜0.05），而多奈哌齊治療組、甲狀腺素治療組、聯合治療組大鼠額葉內乙酰膽堿含量與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義；與甲減組額葉內乙酰膽堿含量相比，甲狀腺素治療組差異無統(tǒng)計學意義，而聯合治療組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 大鼠額葉各層munc-18表達變化肉眼觀察大鼠腦切片，額葉結構清晰，呈棕黃色。光鏡下觀察正常對照組：munc-18在額葉各層內廣泛表達；Ⅰ層水平纖維較多，細胞結構少；Ⅱ層主要見顆粒狀排列致密的神經細胞；Ⅲ層可見排列松散大小不等的棕黃色錐體細胞，其中有少量的星形細胞；Ⅳ層可見少量小錐體細胞和大量排列密集的棕黃色星形細胞；Ⅴ層由大量的棕黃色大錐體細胞和少量的小星形細胞組成。各組額葉內munc-18免疫反應的陽性顆粒分布相似，甲減組和多奈哌齊治療組額葉內錐體細胞的長度增加，樹突棘的密度下降，以Ⅲ／Ⅴ層明顯；甲狀腺素治療組和聯合治療組錐體細胞恢形態(tài)正常，見圖1。形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)量化各組大鼠額葉Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層內munc-18免疫反應產物的AOD值：甲減組、多奈哌齊治療組大鼠額葉Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層的AOD值與正常對照組相比均明顯降低（F＝3.08、10.45、4.28、7.33，P＜0.05），以Ⅲ／Ⅴ層顯著（P＜0.01）；甲狀腺素治療組的munc-18免疫反應產物的AOD值仍然偏低（P＜0.05），聯合治療組的AOD值恢復至正常對照組水平。見圖1、表3。

表1 各組大鼠血清T3、T4、TSH水平（n＝8，±s）

與正常對照組比較：**P＜0.01

組別T3（nmol／L）T4（nmol／L）TSH（μmol／L）正常對照0.83±0.1050.10±4.010.96±0.25甲減0.61±0.06**18.20±4.89**21.27±9.90**多奈哌齊治療0.58±0.05**19.10±3.12**21.02±11.10**甲狀腺素治療0.80±0.2551.28±5.161.33±0.98聯合治療0.82±0.2254.53±6.051.02±0.37

表2 各組大鼠額葉內乙酰膽堿含量（μg／mg，n＝8，±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與甲減組比較：＃P＜0.05

組別乙酰膽堿正常對照23.43±5.81甲減17.58±2.70*多奈哌齊治療20.61±3.24甲狀腺素治療20.00±4.24聯合治療23.37±4.49＃

3 討論

表3 各組大鼠額葉內munc-18表達情況（n＝8，±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別Ⅰ層Ⅱ層Ⅲ層Ⅳ層Ⅴ層正常對照17.49±2.4217.12±2.1112.93±2.659.50±3.6212.12±3.35甲減15.58±3.8412.67±3.77**7.16±4.14**5.13±2.28*5.38±3.54**多奈哌齊治療15.21±4.0813.87±3.92*8.10±1.07**5.77±1.94*5.27±2.03**甲狀腺素治療17.48±1.9414.55±2.1810.04±1.56*8.80±3.868.01±2.99*聯合治療18.93±1.9416.98±3.3113.75±2.0610.53±3.5910.83±3.99

本研究顯示成年期甲減組大鼠額葉內乙酰膽堿含量減少，給予多奈哌齊、甲狀腺素或聯合治療后，乙酰膽堿含量均恢復正常，其中甲狀腺素聯合多奈哌齊治療有進一步恢復趨勢。甲減可以損害額葉中與學習記憶功能密切相關膽堿能系統(tǒng)，本研究也證實了這點，其原因可能與甲減影響膽堿能神經元的數量和形態(tài)有關［8］，也可能通過損害syntaxin-1、SNAP-25等突觸相關蛋白的表達影響神經遞質的釋放［3］。另外，有研究［5］證實鼠類大腦中munc-18參與乙酰膽堿的釋放，甲減大鼠乙酰膽堿含量減少可能與munc-18表達下降有關。給予多奈哌齊治療2周后，額葉內乙酰膽堿含量恢復，這與文獻［9］報道相符。多奈哌齊聯合甲狀腺素治療后，與單獨多奈哌齊治療或甲狀腺素治療相比，額葉內乙酰膽堿含量有進一步恢復趨勢。以上結果提示應用多奈哌齊可改善甲減大鼠額葉內乙酰膽堿的含量異常，特別是在甲狀腺素替代治療的基礎上。

免疫組化結果顯示成年期甲減大鼠額葉munc-18表達減少，其中以Ⅲ／Ⅴ層最為顯著。Carageorgiou et al［10］研究顯示甲狀腺素可以調節(jié)腦內蛋白質的合成。munc-18是神經元胞內蛋白，其表達減少可能與血清甲狀腺激素水平低下有關。其中，額葉各層的損傷程度表現不一致，Ⅲ／Ⅴ層內甲狀腺激素缺乏對munc-18表達的影響最為明顯，可能與這兩層內絕大部分區(qū)域為錐體細胞有關。有文獻［11－12］報道甲減損傷海馬和額葉內的錐體細胞明顯，其所在區(qū)域是比較容易損傷、改變的區(qū)域。

甲狀腺素替代治療是臨床治療甲減的標準療法。本研究顯示甲減大鼠生理劑量的甲狀腺素治療2周后，額葉內munc-18的表達沒有恢復到正常水平。額葉內munc-18表達未完全恢復或許與治療時間有關。Alzoubi et al［13］發(fā)現生理劑量的甲狀腺素治療6周可以逆轉海馬內的神經顆粒素、鈣調蛋白等突觸蛋白表達異常，替代治療時間較短可能是munc-18表達不完全恢復的一個重要因素；額葉內munc-18表達未完全恢復也可能與替代治療劑量不足有關。既往有文獻［14］指出：血清中甲狀腺激素濃度遠遠高于其在中樞神經系統(tǒng)中的濃度，激素替代治療后，血清甲狀腺激素水平可以恢復至一個比較寬的正常范圍，這時中樞神經系統(tǒng)中的激素水平可能尚未達到正常。

先前一項嘗試給予大劑量甲狀腺素治療至亞甲亢水平的研究［12］，發(fā)現甲減大鼠2周激素替代治療后海馬內munc-18表達恢復正常。大劑量甲狀腺素治療有誘導甲亢的風險，本研究在常規(guī)甲狀腺素治療基礎上加用多奈哌齊，發(fā)現甲狀腺激素水平正常后額葉munc-18表達也恢復正常。多奈哌齊作為一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，近年來動物實驗研究［7］表明其有神經保護的作用，聯合治療組中大鼠額葉munc-18恢復正常可能是多奈哌齊神經保護作用的體現。

綜上所述，甲減可引起額葉內乙酰膽堿含量改變和munc-18異常表達，單獨甲狀腺素替代治療至甲狀腺激素水平正常時，上述損害未完全恢復，甲狀腺素聯合多奈哌齊恢復，提示甲狀腺素與多奈哌齊聯合治療可能有利于甲減腦額葉損害恢復。

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Effect of thyroxine and donepezil on acetylcholine content and munc-18 expression in the frontal cortex of rats with adult-onset hypothyroidism

Cai Yaojun，Zha Xiaoxue，Ning Dan，et al
（Dept of Geriatrics Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investgate the thyroxine and donepezil on acetylcholine concentration and munc-18 expression in the frontal lobe of adult-onset hypothyroid rats and clarify the possible molecular mechanism of frontal lobe lesions of hypothyroidism.MethodsThe models of hypothyroidism were established by induction with adding propylthiouracil drinking water for 6 weeks，and since the fifth week，the hypothyroid rats received a two-week treatment of levothyrocine（L-T4），donepezil or a combination of both drugs.The levels of serum triiodothyronine（T3），tetraiodothyronine（T4），thyroid-stimulating hormone（TSH）were measured by radioimmunoassay kits，acetylcholine concentration in frontal lobe was determined by alkaline hydroxylamine colorimetry and the expression and distribution of munc-18 in frontal cortex were evaluated by immunohistochemistry.ResultsIn the hypothyroid rats，the levels of serum T3 and T4 decreased with the increase of TSH（P＜0.01），the content of acetylcholine in frontal lobe was significantly decreased（P＜0.05），and the expression of munc-18 was at significantly lower levels in theⅡ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴlayers of frontal cortex（P＜0.05）.In addition，donepezil treatment reversed the content of acetylcholine to normal values.L-T4 monotherapy normalized the level of serum thyroid hormone and acetylcholine content while the expression of munc-18 was not.Munc-18 was normalized completely by co-administration of L-T4 and donepezil.ConclusionThe alteration of acetylcholine content and expression of munc-18 in the frontal lobe of adult-onset hypothyroidism can be better ameliorated by co-administration of L-T4 and donepezil.

hypothyroidism；frontal cortex；acetylcholine；munc-18；levothyrocine；donepezil

R 581.2；R 322.81；R 446.6-3；R 977.14

1000－1492（2015）01－0025－05

2014－09－18接收

國家自然科學基金（編號：81272152）

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年內分泌科，合肥2300222安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院綜合實驗室，合肥 230032

蔡瑤俊，男，碩士研究生；朱德發(fā)，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：zdfa0168＠sina.com