盧 健 傅得均 吳東芬 劉 瑜 駱耀平*

(浙江大學茶葉研究所，杭州310058;2.金華萌芽茶業(yè)有限公司，金華321042)

香氣是茉莉花茶品質(zhì)評價的重要因子，在花茶感官審評權(quán)重占40%［1］。因此，分析研究茉莉花茶中的揮發(fā)性物質(zhì)，對于探究花茶的香氣品質(zhì)形成以及改進加工工藝具有重要的參考價值。前人對茉莉花茶揮發(fā)性成分研究時，多采用SDE法進行揮發(fā)性物質(zhì)的提?。?-8］。但該法提取溫度較高(影響受溫度變化揮發(fā)性物質(zhì)量的變化)，提取時間較長，過程繁瑣。20世紀90年代初興起的SPME法，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，具有樣品用量少、選擇性高、使用方便、快捷等優(yōu)點，自問世來便廣泛應用于氣態(tài)、水體、固態(tài)樣品中的揮發(fā)物和半揮發(fā)性有機物以及無機物的分析［9］，并已用于茶葉揮發(fā)性成分的萃取。該法對茉莉花茶揮發(fā)性物質(zhì)進行萃取已有報道［10-13］，但SPME方法下對花茶揮發(fā)性物質(zhì)的萃取條件不盡相同，結(jié)果差異較大。為使試驗結(jié)果得到比較，借鑒前人的研究結(jié)果，探索利用SPME法萃取茉莉花茶揮發(fā)性組分的測定條件，為之后的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用傳統(tǒng)二窨一提加工工藝窨制而成的茉莉花茶(為防止白蘭花中揮發(fā)性物質(zhì)對測定的干擾，未用其打底)。用于加工茉莉花茶的原料為福鼎大白茶品種加工而成的烘青毛茶，精制后作為加工花茶的茶坯。付窨用花為雙瓣茉莉，采自金華市婺城區(qū)金店村。加工而成的茉莉花茶樣以鋁箔袋密封，保存于-20℃冰柜中待用。

1.2 試驗試劑與主要儀器設備

試驗用化學試劑為分析純。正構(gòu)烷烴混標(nalkane，C8-C20，Sigma-Aldrich，USA)。

SPME手持器(SAAB-57330U)和65 μm聚二甲基/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取頭(美國Supelco公司);6890氣相色譜-5973質(zhì)譜儀(Agilent公司);50 mL頂空萃取瓶;BS124S電子天平(Sartorius公司);HH-2型可控數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 SPME萃取條件的優(yōu)化 本試驗采用能夠更好保持完整香氣信息的干茶法［14，15］，即直接將干茶置于萃取瓶中，封口膜密封后，插入萃取頭進行萃取。根據(jù)"相似相溶"原理，分析前人試驗結(jié)果，試驗選用對極性揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果較好的65 μm PDMS/DVB萃取頭。利用SPME法萃取揮發(fā)性物質(zhì)，其效果受萃取纖維固定相、萃取溫度、萃取時間、樣品體積等因素影響［16］。本試驗研究了試驗用茶量、萃取溫度和萃取時間三個因素對茉莉花茶萃取效果的影響。在試驗因素的水平設置時，本試驗除了對待優(yōu)化因素設置不同水平外，其他因素參考了本課題組之前對綠茶揮發(fā)性物質(zhì)確定的優(yōu)化條件，用茶量依試驗結(jié)果定。

(1)試驗用茶量 茶葉中揮發(fā)性物質(zhì)萃取研究中，不同茶類的用茶量從 2g 到 10g 不等［14，15］，依前人試驗的結(jié)果，本試驗選設 2.5 g、5 g、7.5 g 和 10 g四個處理，另選擇本實驗室已獲萃取溫度60℃、萃取時間40 min［17］的試驗條件，置茶樣于50 mL萃取瓶中，在60℃水浴條件下萃取40 min。

(2)萃取溫度 已有研究綠茶、烏龍茶、黃茶、普洱茶和茉莉花茶中揮發(fā)性物質(zhì)，所選萃取溫度分別有 60℃、60℃、80℃、40℃和 50℃［15，17-20］。據(jù)此，本試驗設 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃五個處理。選擇萃取時間40 min，試驗用茶量依上一試驗優(yōu)化結(jié)果確定。

(3)萃取時間各地研究中對茶葉揮發(fā)性物質(zhì)測定的萃取時間有較大差異，資料表明，所用時間從20 ～80 min 不等［14，15，17-20］，為此，本試驗設 20 min、40 min、60 min、80 min四個萃取時間，選擇萃取溫度60℃，根據(jù)試驗用茶量試驗選擇合適的用茶量。

1.3.2 揮發(fā)性化合物的氣相質(zhì)譜分析(GC/MS)SPME萃取完成后，將纖維頭插入GC進樣口，熱解吸附3.5 min。每一樣品重復3次。

GC條件:色譜柱為HP-innowax色譜柱(30 m×0.25 mm ID ×0.25 μm 膜厚);載氣為高純 He，流速1.0 mL/min;進樣口溫度為250℃，ECD檢測器溫度為250℃;初始柱溫為50℃，保持5 min，以3℃/min升溫至220℃，保持5 min，再以10℃/min升溫至240℃，保持5 min，不分流進樣。

MS條件:離子化方式為EI，離子源溫度230℃，四級桿的溫度150℃，電子能量70 eV，檢測器電壓350 V，色譜-質(zhì)譜接口溫度260℃，質(zhì)量掃描范圍為35 ～450 a.m.u.。

1.3.3 揮發(fā)性化合物的數(shù)據(jù)處理與分析 物質(zhì)的譜庫鑒定、MS峰鑒定及保留指數(shù)(RI)鑒定方法同林杰［15］。

以往對茉莉花茶揮發(fā)性物質(zhì)的研究表明，茉莉花茶中芳樟醇、乙酸芐酯、α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯、吲哚六種物質(zhì)相對含量最大，約占全部揮發(fā)性物質(zhì)的 85%［2］(SDE法)或79%［13］(SPME法)。在進行試驗優(yōu)化萃取條件時，選擇該六種物質(zhì)為主要比較對象。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件包(Version 16.0 for Windows，SPSS Inc.Chicage，Ⅱ，2007)進行數(shù)據(jù)分析，平均值之間比較采用單因素方差分析，不同處理間差異采用Duncan法進行多重比較檢驗，顯著性水平設定為α =0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗用茶量對萃取效果的影響

已有研究表明，茉莉花茶中芳樟醇、乙酸芐酯、α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚六種揮發(fā)性物質(zhì)相對含量約占全部揮發(fā)性物質(zhì)的 85%［2］(SDE 法)或 79%［13］(SPME 法)，選擇這六種物質(zhì)分析比較，利于主要問題的剖析。不同試驗用茶量與茉莉花茶中六種大量揮發(fā)性組分峰面積的關(guān)系如圖1所示。結(jié)果表明，六種物質(zhì)中，有些隨用茶量增加，峰面積對數(shù)值變化小，有些超過一定用茶量后，峰面積對數(shù)值下降。芳樟醇和乙酸芐酯兩種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對數(shù)值在各不同用茶量處理下變化小，處理間差異不顯著。其它四種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對數(shù)值，在用茶量小于5 g范圍內(nèi)差異不顯著;鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚的峰面積對數(shù)值，用茶量7.5 g時，與之前用茶量條件下差異不顯著，用茶量10 g時顯著低于5 g處理;α-法尼烯和苯甲酸順-3-己烯酯，在用茶量超過5 g時，峰面積對數(shù)值下降，且與5 g用茶量差異顯著。換言之，六種主要成分中，有兩種成分的峰面積對數(shù)值在7.5 g與5 g處理間差異顯著。由此認為，利用SPME檢測茉莉花茶揮發(fā)性物質(zhì)時，花茶揮發(fā)性物質(zhì)中占80%以上的六種物質(zhì)的萃取量，在用茶量2.5 g～5 g時變化較穩(wěn)定。

圖1 不同用茶量對茉莉花茶中六種香氣成分萃取效果的影響

2.2 萃取溫度對萃取效果的影響

SPME提取、富集樣品的過程是一個動態(tài)平衡過程，溫度通過影響揮發(fā)性物質(zhì)在各相之間的分配系數(shù)，對萃取效果產(chǎn)生影響［16］。不同萃取溫度條件下，六種主要揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效果如圖2所示，由圖可以看到，萃取溫度60℃，是這六種揮發(fā)性物質(zhì)峰面積對數(shù)值變化的轉(zhuǎn)折點。α-法尼烯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚三種物質(zhì)低于60℃時，峰面積對數(shù)值隨溫度升高而快速增加，各溫度處理間差異顯著，高于60℃時峰面積對數(shù)值變化量差異不顯著;苯甲酸順-3-己烯酯在60℃之前溫度條件下萃取，峰面積對數(shù)值也是增加，且增加速度明顯較前面三種物質(zhì)快，50℃、60℃處理的峰面積對數(shù)值與前一處理相比分別增加了4.02%和3.75%(前面三種物質(zhì)峰面積對數(shù)值增加最快的為3.26%);之后的溫度處理下，仍有增加，但增加速率減緩，70℃、80℃處理的峰面積對數(shù)值與前一處理相比分別增加了1.16%和0.89%;其他兩種物質(zhì)在不同萃取溫度處理下，峰面積對數(shù)值的變化表現(xiàn)為隨萃取溫度升高，峰面積對數(shù)值減少。其中，乙酸芐酯在60℃之前，曲線變化有下降趨勢，顯著性測定不顯著，萃取溫度高于60℃時，顯著下降;芳樟醇在60℃之前下降快速，之后，變化不顯著。根據(jù)這六種揮發(fā)性物質(zhì)的綜合變化，萃取溫度60℃時，這些揮發(fā)性物質(zhì)處于一個較高或較穩(wěn)定的位置，因此，利用該方法的萃取溫度選擇60℃合適。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響

2.3 萃取時間對萃取效果的影響

不同萃取時間與茉莉花茶中六種大量揮發(fā)性物質(zhì)峰面積變化關(guān)系如圖3所示，可以看出，隨萃取時間的增加，六種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對數(shù)值先增加，40 min時，峰面積對數(shù)值處于較高位置，增加較多的α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚四種物質(zhì)的峰面積對數(shù)值與20 min時相比，分別增加了 2.41%、3.61%、1.86% 和 1.36%。40～60 min六種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對數(shù)值處于一個相對穩(wěn)定的變化中，80min時略有下降。在試驗處理時間內(nèi)，乙酸芐酯峰面積對數(shù)值變化不顯著。芳樟醇峰面積對數(shù)值隨時間的延長有下降趨勢，20 min處理和80 min處理下差異顯著，其他時間處理下差異不顯著。其他四種揮發(fā)性物質(zhì)峰面積對數(shù)值隨萃取時間延長有較一致的變化。萃取時間為20～40 min時，四種揮發(fā)性物質(zhì)峰面積對數(shù)值顯著增加;萃取時間超過40 min，苯甲酸順-3-己烯酯的峰面積對數(shù)值仍增加，但趨勢減緩，萃取60 min時與40 min萃取結(jié)果差異顯著;其它三種揮發(fā)性物質(zhì)在40～80 min范圍內(nèi)變化差異不顯著。

HS-SPME萃取過程是待測物在介質(zhì)相、頂空相和萃取纖維相的分配平衡過程，要達到動態(tài)平衡需要一定的時間。由試驗結(jié)果可以看到，萃取時間在20～40 min(包括40 min)范圍內(nèi)，α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚四種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對數(shù)值隨時間的增加顯著增加;萃取時間40～60 min，六種揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積對數(shù)值處于一個相對穩(wěn)定的變化中，80 min時略有下降。因此，萃取時間以40～60 min為合適。

3 討論

茉莉花茶中已提取分析得到七十種以上揮發(fā)性物質(zhì)［15］，是一個多組分、多相的混合系統(tǒng)，這些物質(zhì)的揮發(fā)性強弱、沸點等性質(zhì)不同，被茶坯吸附的能力不同，有些吸附后不易分離，有些則相反，隨時間、用茶量、溫度等變化，這些性質(zhì)都會得到反映。

圖3 萃取時間對萃取效果的影響

試驗條件下，占揮發(fā)性物質(zhì)約80%的六種物質(zhì)，不同用茶量處理時，以用茶量2.5～5 g時物質(zhì)變化較為穩(wěn)定，超過5 g用茶量，差異較大，可見并非是用茶量越多萃取效果越佳。以往一些研究有10 g用茶量處理，此時，主要的六種物質(zhì)中有四種揮發(fā)性物質(zhì)(α-法尼烯、苯甲酸順-3-己烯酯、鄰氨基苯甲酸甲酯和吲哚)與用茶量小時(5 g)差異顯著，與相鄰處理也有較大差異。因此，試驗用茶量以2.5～5 g為合適。

萃取溫度優(yōu)化試驗結(jié)果表明，當萃取溫度在60℃以下時，六種主要物質(zhì)峰面積對數(shù)值還處于較大的變化之中，60℃ ～80℃時，變化較小。由此認為，60℃ ～80℃溫度范圍內(nèi)萃取是合適的溫度條件，但在合適溫度范圍條件下，較低溫度對因不同溫度變化而帶來影響的揮發(fā)性物質(zhì)的保持有利［14］，據(jù)此，優(yōu)先選擇萃取溫度條件為60℃。

不同萃取時間內(nèi)，主要的六種揮發(fā)性物質(zhì)量都有不同的變化，萃取時間40～60 min范圍內(nèi)，六種揮發(fā)物質(zhì)峰面積隨時間變化趨緩。因此，萃取時間以40～60 min為宜。

物質(zhì)的飽和蒸汽壓越大，揮發(fā)性越強。六種主要揮發(fā)性物質(zhì)中，芳樟醇和乙酸芐酯的飽和蒸汽壓高于其它四種物質(zhì)［21］，推知芳樟醇和乙酸芐酯比其它四種物質(zhì)的揮發(fā)性強。此外，芳樟醇和乙酸芐酯的沸點低于其它四種物質(zhì)。因此，不同溫度、時間優(yōu)化時可以看到這兩種物質(zhì)的含量均在較短時間和較低溫度下達到較高水平。

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