呂立國(guó) 張 嫻 吳巧玲 陳志強(qiáng) 白遵光 王昭輝 代睿欣 王樹聲

前列腺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第二的男性惡性腫瘤［1］，確診時(shí)多為晚期，內(nèi)分泌治療后幾乎都會(huì)發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)，中位生存期短。如何延緩?fù)砥谇傲邢侔┻M(jìn)展為CRPC、如何延長(zhǎng)CRPC 生存期，是世界范圍內(nèi)的治療難點(diǎn)。中醫(yī)藥治療CRPC 逐漸成為研究的熱點(diǎn)。初步臨床研究顯示，以蜂毒為主要作用成分的蜂針療法在控制前列腺癌進(jìn)展方面有一定的作用［2］，初步的實(shí)驗(yàn)研究顯示，蜂毒對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用［3］。本研究擬在前期臨床與實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究蜂毒對(duì)PC-3 細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)理，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為CRPC 的治療提供思路。

1.材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物 蜂毒注射液，購(gòu)于長(zhǎng)春博奧生化制藥有限公司，批號(hào):20120301。

1.2 細(xì)胞 前列腺癌細(xì)胞PC-3 購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試劑 MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液(Gibco 公司);四氮甲基唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigma 公司)、Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、Fluo-3AM(南京凱基生物公司)。

1.4 儀器 多功能免疫分析儀(Perkin Elmer，VICTORTMX5)，熒光倒置顯微鏡(Leica，DMI2500)，流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，F(xiàn)C500)。

1.5 方法 前列腺癌細(xì)胞用含5%FBS 的DMEM，均在37℃，5% CO2，飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)設(shè)蜂毒注射液不同濃度組和空白對(duì)照組。

1.5.1 MTT 實(shí)驗(yàn):細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，接種至96 孔培養(yǎng)板，每孔100μl，設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后加入作用藥物蜂毒注射液，設(shè)FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，20μg/ml，24μg/ml 作用到時(shí)間點(diǎn)，后加入5% MTT 溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時(shí)，吸去上清，每孔加入100μL DMSO 溶液，振蕩溶解后酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm OD 值。

1.5.2 Annexin V/PI 雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:設(shè)FD1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml 和空白對(duì)照組，細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞貼壁后加入藥物處理24 小時(shí)，收集細(xì)胞300×g 離心5 分鐘，棄上清，加入500μL 結(jié)合緩沖液，5μL Annexin-FITC 和5μL PI 染液，避光孵育15 分鐘后上機(jī)細(xì)胞凋亡率。

1.5.3 Hoechst33258 凋亡染色:設(shè)組和前處理同1.5.2，后加入Hoechest33258 染液，后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度:細(xì)胞接種于6孔板中細(xì)胞貼壁后加入藥物處理24 小時(shí)，加入Fluo-3-Am 至10μmol/L，置二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育30 分鐘，收集細(xì)胞，RCF300×g 離心，去掉多余的染料。再用D-PBS 洗滌2 次，后用D-PBS 重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以此分析Ca2+濃度。

2.結(jié)果

2.1 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖1 可見，與空白對(duì)照組比較，F(xiàn)D1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml 組，OD 值無明顯差異，F(xiàn)D8μg/ml，12μg/ml，16μg/ml，20μg/ml，24μg/ml 組OD 值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞活性的影響

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 由圖2 可見，與空白對(duì)照組比較，F(xiàn)D1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml 組，無明顯差異，F(xiàn)D8μg/ml 作用24 小時(shí)后細(xì)胞凋亡明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡的影響

圖3 FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡的影響

2.3 Hoechst 33258 由圖4 可見，與空白對(duì)照組比較，F(xiàn)D1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml 組無明顯變化，F(xiàn)D8μg/ml 作用24小時(shí)后在熒光顯微鏡下能見凋亡細(xì)胞增多。

圖4 FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡影響(Hoechst 33258 染色)

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 從圖5 可以看到，在FD4μg/ml，8μg/ml 處理后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，尤其以FD8μg/ml 組最為顯著。

圖5 FD 對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響

3.討論

蜂針療法是中醫(yī)傳統(tǒng)療法，具有抗腫瘤的作用，臨床研究顯示，蜂針療法在控制前列腺癌進(jìn)展方面有明確的作用。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)蜂毒肽對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用［3］。臨床與實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了蜂毒的療效，鑒于蜂針療法、蜂毒肽臨床應(yīng)用的局限性，我們選取了由蜂毒提取制成的已批準(zhǔn)的臨床藥品蜂毒注射液進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)研究，為進(jìn)一步拓展蜂毒的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)表明，蜂毒注射液在8μg/ml 以上濃度時(shí)，前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖抑制明顯，進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst 33258 染色熒光顯微鏡觀察證實(shí)，蜂毒注射液在8μg/ml 以上濃度，作用24 小時(shí)后細(xì)胞凋亡明顯增多，由此證實(shí)，蜂毒注射液可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡。

既往實(shí)驗(yàn)已證實(shí)p27、p53 是蜂毒誘導(dǎo)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡的途徑之一［3］。腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理是多方面的。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了前列腺癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，發(fā)現(xiàn)4μg/ml，8μg/ml 濃度的蜂毒注射液可以引起PC-3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高。

鈣離子與細(xì)胞凋亡之間關(guān)系密切。凋亡的調(diào)控由十分復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)控制，目前已知有三條主要信號(hào)通路:線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、死亡受體通路，大部分與鈣離子有關(guān)。在鈣離子信號(hào)與腫瘤細(xì)胞凋亡的三條通路中，存在相互促進(jìn)、互為因果的促凋亡蛋白酶，加速腫瘤細(xì)胞凋亡。鈣穩(wěn)態(tài)的破壞可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡［4］，通過升高胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度，可激活相關(guān)凋亡活化因子，可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡［5］。由此推測(cè)，蜂毒注射液可以導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，誘導(dǎo)其凋亡。

本實(shí)驗(yàn)在揭示了蜂毒注射液對(duì)前列腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及部分可能的機(jī)制，為蜂毒注射液臨床治療前列腺癌提供了理論依據(jù)，為CRPC 的治療提供了思路。蜂毒注射液在體內(nèi)應(yīng)用是否具有明確的作用，有待進(jìn)一步的深入研究。

1 那彥群，葉章群，孫穎浩，等.中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南:2014 版［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2013:61.

2 呂立國(guó)，陳志強(qiáng)，吳巧玲，等.蜂針療法治療前列腺癌的臨床應(yīng)用［J］.新中醫(yī)，2014，46(12):254-255.

3 呂立國(guó)，白遵光，張嫻，等.蜂毒肽對(duì)前列腺癌PC-3 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的影響［J］.中國(guó)男科學(xué)雜志，2014，28(9):13-16.

4 鄺祥醒，李本義.L 型鈣離子通道與前列腺癌的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志，2013，5(4):249-251.

5 李玉.鈣離子通道在前列腺疾病的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志，2009，29(3):370-376.