渠桂榮 王菲菲 郭海明 王東超 李建平 趙揚(yáng)

摘要：本文介紹了一種提取蘆丁的新方法，即以水為溶劑、石灰乳調(diào)節(jié)堿性、超聲波破碎細(xì)胞壁，從裂葉苣荬菜或槐米中分離提取蘆丁。利用UV、IR、1H-NMR波譜技術(shù)結(jié)構(gòu)對(duì)所提取的蘆丁進(jìn)行了表征，同時(shí)對(duì)蘆丁的療效、用途與開發(fā)的價(jià)值做了簡(jiǎn)要介紹。該實(shí)驗(yàn)知識(shí)要點(diǎn)多、學(xué)科覆蓋面廣、友好環(huán)境無(wú)污染、貼近生活、安全可操作性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)效果好、能調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，有利于培養(yǎng)學(xué)生綜合能力與創(chuàng)新思想的形成，體現(xiàn)了科研成果轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的優(yōu)越性。

關(guān)鍵詞：蘆丁；綠色提取；結(jié)構(gòu)表征；綜合實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2015）10-0234-02

大學(xué)教育改革的總體目標(biāo)是提高大學(xué)生的動(dòng)手能力、創(chuàng)新能力和服務(wù)于社會(huì)的能力，實(shí)驗(yàn)教學(xué)正是培養(yǎng)創(chuàng)新人才的重要途徑?；A(chǔ)單元操作實(shí)驗(yàn)?zāi)茏寣W(xué)生了解和體驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的過程，提高學(xué)生的動(dòng)手能力，綜合實(shí)驗(yàn)與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)茏寣W(xué)生既動(dòng)手又動(dòng)腦，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)實(shí)驗(yàn)素養(yǎng)，逐步提高學(xué)生解決實(shí)際問題的能力，從而真正提高學(xué)生的創(chuàng)新能力與綜合素質(zhì)。我們作為國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，多年來牢牢抓住基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，以培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐動(dòng)手能力與探索精神為目標(biāo)，力求發(fā)現(xiàn)、發(fā)展與挖掘?qū)W生的個(gè)性與潛質(zhì)。我們以培養(yǎng)學(xué)生基本操作技能、實(shí)際動(dòng)手能力和創(chuàng)新能力為主線，構(gòu)建了抓住基礎(chǔ)、推崇應(yīng)用、重視能力、引領(lǐng)創(chuàng)新為核心的實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程體系，采取迎合市場(chǎng)需求、分專業(yè)按需求的分流培養(yǎng)模式，獲得河南省教學(xué)成果一等獎(jiǎng)[1]。在該課程體系中學(xué)生的應(yīng)用與創(chuàng)新能力培養(yǎng)是關(guān)鍵，必須借助于后期的綜合實(shí)驗(yàn)與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來完成。為了提高設(shè)計(jì)性和綜合性實(shí)驗(yàn)比例，開發(fā)、凝練、建設(shè)一批能激發(fā)學(xué)生興趣、啟迪科學(xué)思維、訓(xùn)練探索精神、引導(dǎo)學(xué)生創(chuàng)新的實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，我們實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心每年都面向全院教師征集本科生綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目。要求教師從自己的科研成果中尋找盡可能貼近生活，貼近社會(huì)，與學(xué)科前沿相結(jié)合并能激發(fā)學(xué)生科研興趣的研究?jī)?nèi)容。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上力爭(zhēng)做到使用無(wú)毒或少毒的藥品或試劑，體現(xiàn)綠色化學(xué)的教學(xué)理念，在實(shí)驗(yàn)儀器使用上盡可能選擇實(shí)驗(yàn)中心現(xiàn)有儀器設(shè)備，同時(shí)考慮實(shí)驗(yàn)成本、實(shí)驗(yàn)的可行性和安全性等因素。通過申述答辯、專家評(píng)審逐項(xiàng)打分、優(yōu)中選優(yōu)，被選中的項(xiàng)目將有專門的經(jīng)費(fèi)資助其完成開課前的試做與準(zhǔn)備工作?！疤J丁的綠色分離提取方法與結(jié)構(gòu)表征”便是2009年被實(shí)驗(yàn)中心選中的項(xiàng)目。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是作者承擔(dān)完成的國(guó)家新藥基金項(xiàng)目的部分內(nèi)容，是科學(xué)研究的新成果。該實(shí)驗(yàn)知識(shí)要點(diǎn)多、學(xué)科覆蓋面廣、友好環(huán)境無(wú)污染、貼近生活、成本低、實(shí)驗(yàn)效果好，符合我院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心本科生綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的基本要求，有利于培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力與創(chuàng)新能力，能夠體現(xiàn)科研成果轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的優(yōu)越性。蘆丁，又叫槲皮素-3-氧蕓香糖苷，英文名稱為Rutin，分子式是C27H30O16，分子量為610.51。它是維生素P中的一種重要的黃酮類化合物[2-3]。蘆丁存在于菊科植物裂葉苣荬菜、豆科植物槐米（或槐角）、蕓香科植物蕓香葉、蓼科植物蕎麥花、大戟科植物野梧桐中。多種常用食品大棗、番茄、橙皮、杏中也含有蘆丁。蘆丁具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌、抑菌、抗病毒、抗心腦血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗過敏、利尿、鎮(zhèn)咳、降血脂、降低毛細(xì)管的通透性與脆性等多種藥理活性，也是食療和食補(bǔ)的重要物質(zhì)[4]。在臨床上常用蘆丁及其衍生物防治腦溢血、高血壓、視網(wǎng)膜出血，治療慢性氣管炎、血管發(fā)脆等疾病。蘆丁的衍生物三羥乙基蕓香苷（維腦路通）目前還被廣泛應(yīng)用于臨床，用于治療各種血管疾病及關(guān)節(jié)炎。從各種植物中分離提取蘆丁的方法很多，并已經(jīng)被很多專家廣為研究，例如冷堿滲漉提取-酸沉淀法、乙醇浸提法、丙酮浸提法、超臨界CO2提取法、滲漉法、煎煮法等[5-7]。但這些方法大多數(shù)都存在操作成本高、工藝流程長(zhǎng)、提取效率低、對(duì)環(huán)境不友好等不足之處。本實(shí)驗(yàn)則采取了石灰乳調(diào)節(jié)的堿性水溶液浸泡-超聲波破碎細(xì)胞壁-加熱回流提取-酸中和游離-水重結(jié)晶純化-各種波普表征結(jié)構(gòu)的新工藝，可操作性強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保，真正體現(xiàn)了“學(xué)生為主體，教師為主導(dǎo)”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式，培養(yǎng)了學(xué)生學(xué)習(xí)化學(xué)的興趣，改善了實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，特別適用于本科生做綜合實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.建立從天然植物中分離提取化學(xué)成分的研究思路；

2.掌握通過文獻(xiàn)綜述和已有知識(shí)設(shè)計(jì)研究方案的方法；

3.設(shè)計(jì)綠色提取方案、分離純化黃酮化合物-蘆?。?/p>

4.利用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等手段表征化合物結(jié)構(gòu)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

蘆丁屬于黃酮類化合物，具有一定的酸性，并且其酸性大小與黃酮母核上取代基的種類、取代基的數(shù)目及其相對(duì)位置有關(guān)。蘆丁的分子中含有很多羥基，酸性較大，水溶性也較大。超聲波具有微觀破碎的能力，所以根據(jù)蘆丁的化學(xué)特性和超聲波儀器的簡(jiǎn)單可操作性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用堿性水溶液浸泡，超聲波破碎提取、用無(wú)機(jī)酸酸化游離，然后萃取、用水或乙醇重結(jié)晶即可得到純凈的蘆丁。

三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

1.主要儀器設(shè)備：超聲波裝置（1臺(tái)，常規(guī)），加熱回流裝置（1臺(tái)，常規(guī)），重結(jié)晶裝置（1套，常規(guī)）；

2.主要化學(xué)試劑：石灰乳200ml（自制），裂葉苣荬菜40g（6～7月份采集曬干），槐米40g（7～8月份采集曬干），濃鹽酸5ml（分析純）；

3.檢測(cè)用大型儀器：NMR儀（Bruck-AV-400兆），Bruker Vector 22紅外光譜儀，Lambda-17 UV紫外可見分光光度計(jì)。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

干燥裂葉苣荬菜（Sonchus arvensis L.）或槐米（Sephara japonica L.）40克加約6倍量水，煮沸，在攪拌下緩緩加入石灰乳至pH值達(dá)到8-9，反應(yīng)瓶移至已經(jīng)加熱到80℃的超聲波儀器中，超聲30分鐘，然后微沸回流30分鐘，趁熱抽濾；殘?jiān)显偌?倍量水，石灰乳調(diào)至pH值達(dá)8-9，再移至80℃的超聲波儀器中，超聲30分鐘，微沸回流20分鐘，趁熱抽濾。合并濾液，溫度降至60℃以下，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至5左右，攪勻，靜置24小時(shí)，抽濾。沉淀物水洗至中性，60℃干燥得到蘆丁粗品，用水重結(jié)晶，80℃干燥得到蘆丁純品。

蘆丁的波譜數(shù)據(jù)測(cè)定：

1.在甲醇溶劑中測(cè)定蘆丁的紫外光譜；

2.然后在蘆丁的甲醇溶液中加入三氯化鋁，測(cè)定其紫外光譜；

3.溴化鉀壓片法測(cè)定蘆丁的紅外光譜；

4.在DMSO-D6中測(cè)蘆丁的1H-NMR譜；

5.在DMSO-D6中滴加D2O測(cè)蘆丁的1H-NMR譜。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

操作要點(diǎn)：（1）飽和石灰乳的制備；（2）超聲及微沸提?。唬?）濃鹽酸調(diào)pH值；（4）重結(jié)晶；（5）紫外光譜、紅外光譜、核磁共振圖譜測(cè)試及解析。難點(diǎn)：紫外光譜、紅外光譜、核磁共振圖譜解析（教師指導(dǎo)完成）。紫外光譜中應(yīng)指出黃酮的帶Ⅰ與帶Ⅱ吸收位置，并強(qiáng)調(diào)指明由于B環(huán)上鄰二酚羥基的存在，加入AlCl3后，鄰二酚羥基與鋁絡(luò)合使帶Ⅱ紅移的現(xiàn)象。紅外光譜中讓學(xué)生找出羥基、羰基、芳環(huán)的骨架特征吸收。核磁共振氫譜中首先指出高場(chǎng)區(qū)鼠李糖上甲基的吸收峰（1.00ppm，雙峰）和低場(chǎng)區(qū)產(chǎn)生了分子內(nèi)氫鍵的5位羥基質(zhì)子的吸收（12.00ppm，滴加重水消失），同時(shí)比較滴加重水前后的氫譜，找出所有的羥基質(zhì)子吸收，然后指出芳香質(zhì)子吸收（6.15-7.55ppm）和蕓香糖上質(zhì)子吸收（3.1-5.5ppm），讓本科生認(rèn)識(shí)到用波譜數(shù)據(jù)解釋化學(xué)結(jié)構(gòu)的重要性和科學(xué)性。

六、問題與討論

1.盡可能多地說出你所熟悉的天然植物中所含的化學(xué)成分；

2.請(qǐng)自行設(shè)計(jì)一種天然植物化學(xué)成分的分離提取方案；

3.提取液的堿性用石灰乳調(diào)節(jié)，而不用氫氧化鈉或碳酸鈉水溶液來調(diào)節(jié)的原因？（指出含羥基的雜質(zhì)易生成鈣鹽沉淀，不致溶出。更有利于黃酮類化合物的純化處理）

4.對(duì)比分析蘆丁在MeOH和MeOH/AlCl3中UV譜的差別，討論B環(huán)上鄰二羥基與三氯化鋁絡(luò)合紅移現(xiàn)象在鑒別黃酮中的應(yīng)用[8]。

5.對(duì)比分析蘆丁在DMSO-D6中滴加D2O前后測(cè)得1H-NMR譜的異同，討論該測(cè)試方法還能在哪些研究中應(yīng)用。

七、教學(xué)建議

1.分離提取及純化部分由學(xué)生1人1組，獨(dú)立完成；

2.UV、IR、1H-NMR波譜測(cè)試以學(xué)生小組為單位進(jìn)行，然后波譜數(shù)據(jù)的分析以實(shí)驗(yàn)班為單位由教師指導(dǎo)和講解；

3.實(shí)驗(yàn)報(bào)告除給出本次實(shí)驗(yàn)的做法與體會(huì)外，要求每個(gè)學(xué)生一定自行設(shè)計(jì)一種天然植物化學(xué)成分的提取方案，并給出其可行性、綠色性和先進(jìn)性。

本實(shí)驗(yàn)綜合了天然藥物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、波譜分析等多學(xué)科的知識(shí)，注入了綠色化學(xué)的理念，采用了超聲波破裂細(xì)胞壁和石灰乳調(diào)節(jié)堿性的創(chuàng)新性工藝，這項(xiàng)工藝不僅提高了蘆丁的提取效率，而且石灰乳調(diào)節(jié)堿性的方法能有效地去除其他含羥基的雜質(zhì)化合物，便于產(chǎn)品的分離純化。這是我們承擔(dān)國(guó)家新藥基金《裂葉苣荬菜抗病毒口服液的研究》項(xiàng)目的科研成果之一，該實(shí)驗(yàn)知識(shí)要點(diǎn)多、學(xué)科覆蓋面寬、友好環(huán)境無(wú)污染、貼近生活、成本低、實(shí)驗(yàn)效果好，試驗(yàn)完成后，滿實(shí)驗(yàn)室的清香味，令人心情愉快。該實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在兩屆本科生中開設(shè)，十分有利于培養(yǎng)學(xué)生綜合能力與創(chuàng)新思想的形成，是值得推薦交流的一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。

參考文獻(xiàn)：

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[4]王玉枝等.食療食補(bǔ)功效的重要物質(zhì)-蘆丁[J].大學(xué)化學(xué)，2010，（增）：109-113.

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