孫 學， 吳樹晴， 文紅梅， 崔小兵， 李 偉

（南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210023）

HPLC-ELSD法同時測定生白術中的D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖

孫 學， 吳樹晴， 文紅梅*， 崔小兵， 李 偉

（南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210023）

目的 建立HPLC-ELSD法同時測定生白術中D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖的含有量，并對不同產(chǎn)地 （浙江、安徽和湖北?。┘芭嗡幉闹械倪@3種成分進行分析。方法 生白術提取物的分析采用Waters XBridgeTMAmide色譜柱（4.6mm×250 mm，3.5μm）；流動相為乙腈-水（80：20）；體積流量1.0 mL/min；柱溫40℃。質(zhì)譜測定采用電噴霧離子源（ESI）的飛行時間質(zhì)譜（TOF/MS）；負離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～800。結果 D-果糖在7.943～18.53μg、D-葡萄糖在0.583 5～1.362μg、蔗糖在1.415～3.302μg范圍內(nèi)均呈良好的線性關系 （r＞0.998），其平均回收率分別為101.4%、100.1%、102.0%，RSD分別為1.3%、1.8%、1.3% （n=9）。在10批生白術藥材中，D-果糖含有量為9.946～45.83 mg/g、D-葡萄糖為1.198～7.743 mg/g、蔗糖為5.231～15.76 mg/g。結論 不同產(chǎn)地及批次生白術中的含有量依次為D-果糖＞蔗糖＞D-葡萄糖，并且差異較明顯。

生白術；D-果糖；D-葡萄糖；蔗糖；HPLC-ELSD

白術為菊科植物白術Atractylodesmacrocephala Koidz.的干燥根莖，是多年生草本植物，其性溫，氣清香，味甘苦，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎、中和之功效［1］。該植物主產(chǎn)于浙江、安徽、

湖北、江西等省，多為栽培［2］，并含有揮發(fā)油［3］、內(nèi)酯類［4-10］、 苷類［11-13］、 白術多糖類、 氨基酸［14］等多種類型成分。

一般認為，白術內(nèi)酯和多糖是白術健脾益氣、止汗安胎的活性物質(zhì)，但前者是脂溶性化合物，而后者是大分子物質(zhì)，傳統(tǒng)上大多采用水煎煮法提取服用，故其水提液解析程度是直接影響白術質(zhì)量研究的關鍵環(huán)節(jié)。由于白術水提液中白術內(nèi)酯含有量較少，而多糖含有量較多，并且還存在較多小分子極性成分，因此除白術內(nèi)酯和多糖外，對白術水煎液中其他小分子活性成分的深入研究無疑是一個重要方向。白術的水溶性成分主要為白術多糖、氨基酸和低分子糖等，其中前兩者已有文獻報道，但對低分子糖則尚無相關研究。本實驗通過比較不同單糖和二糖對照品及LC-MS/MS定性，發(fā)現(xiàn)生白術中有三種低分子糖，分別為D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，并首次建立了同時測定這三種成分含有量的HPLC-ELSD法，期冀為白術水提液的質(zhì)量控制及其健脾的物質(zhì)基礎研究提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器 （美國Waters公司）；ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器（美國Alltech公司）；Triple Q-TOF 5600質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源系統(tǒng)（美國AB Sciex公司）；KQ-500B超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；AY2201電子分析天平 （日本島津公司）；TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）；MUL-9000Series超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥材和試劑 生白術 （共10批，產(chǎn)地分別為浙江磐安縣安文鎮(zhèn)崗頭村，批號1408034、浙江磐安縣大磐鎮(zhèn)林豐村，批號1405104、浙江磐安縣大磐鎮(zhèn)小磐村孔榮田，批號1404160、安徽省毫州市譙城區(qū)十九里鎮(zhèn)，批號1410012、湖北巴東縣綠蔥城鎮(zhèn)，批號1403148、安徽毫州，批號1410142、浙江新昌縣儒岙鎮(zhèn)南山村，批號1401041、湖南郴州，批號1308017、湖南廉橋，批號1311086、江西上高，批號 1310167）。乙腈、甲醇 （批號20140301022）均為色譜純 （德國 Merck公司）；水為超純水 （自制）；其余試劑為分析純。

1.3 對照品 D-葡萄糖 （批號110833-200904）、蔗糖 （批號 111207-200001）、D-果糖 （批號100231-200303）、麥芽糖 （批號 100287-201102）對照品 （中國食品藥品檢定研究院）；木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖對照品 （南京中醫(yī)藥大學）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters XBridgeTMAmide色譜柱（4.6 mm×250 mm，3.5μm）；柱溫40℃；流動相為乙腈-水（80：20）；體積流量1.0 mL/min；漂移管溫度90℃；氮氣體積流量1.5 L/min；冷卻模式；分析時間30 min；進樣量10μL，HPLCELSD色譜圖見圖1。

圖1 生白術中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖的HPLC-ELSD色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatogram s of D-fructose，D-gIucose and sucrose in Atractylodes macrocephala Koidz.

2.2 質(zhì)譜條件 TOFMS-IDA-MS/MS模式；電噴霧離子源 （ESI），采用動態(tài)背景扣除 （DBS）法；負離子模式下采集；霧化器電壓 （GS1）55 psi；輔助加熱器電壓（GS2）55 psi；氣簾氣（Curtain Gas）36 psi；輔助加熱器溫度 （TEM）550℃；噴霧電壓（IS）-4 500 eV；去簇電壓（DP）-100 eV；碰撞電壓（CE）-40 eV；碰撞電壓差15 eV；質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z50～800。

2.3 對照品溶液的配制 精密稱取在P2O5干燥器中干燥12 h后的D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖對照品適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，加50%乙腈溶解，稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 mL分別含D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖3.890、3.145和0.725mg的

對照品貯備液。然后，分別精密量取D-果糖1.7 mL、D-葡萄糖0.15mL、蔗糖貯備液1.6 mL，置于5 mL量瓶中，加50%乙腈定容至刻度，配制成每1 mL分別含D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖1.323、0.094 4和0.232 mg的混合對照品溶液，即得。

2.4 供試品溶液的配制 精密稱取藥材粗粉10 g，加12倍量水，回流提取2次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至10 mL左右，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。然后，精密吸取儲備液1 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置過夜，即得。實驗時取適量，高速離心（14 000 r/min）10min，0.45μm微孔濾膜濾過，注入HPLC色譜儀分析。

2.5 線性關系考察 精密吸取上述混合對照品溶液6、8、10、12、14μL，測定D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖的峰面積，以其對數(shù)值為縱坐標 （Y），進樣量 （μg）的對數(shù)值 （logM）為橫坐標 （X），繪制標準曲線，發(fā)現(xiàn)在三者一定范圍內(nèi)均呈良好的線性關系 （r＞0.998），結果見表1。

表1 D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖的線性關系（n=5）Tab.1 Linear reIationships of D-fructose，D-gIucose and sucrose（n=5）

2.6 精密度試驗 精密吸取D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖混合對照品溶液適量，在 “2.1”項色譜條件下進樣10μL，連續(xù)5次，測定峰面積RSD。結果，D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖的RSD分別為0.07%、0.34%和0.14%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批號 （1408034）生白術藥材6份，每份10 g，按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣分析，測定樣品峰面積RSD，按外標兩點法計算D-果糖、D-葡萄糖及蔗糖的含有量 （mg/g）。結果，三者的RSD分別為2.8%、0.42%和2.1%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液 （批號1408034）適量，在 “2.1”項色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12、14 h進樣10μL分析，測定D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖峰面積RSD。結果，三者的RSD分別為0.10%、0.15%、0.09%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 最低檢測限、定量限試驗 分別進樣D-果糖（25.15μg/m L）2μL、D-葡萄糖（38.90μg/m L）3μL、蔗糖對照品 （31.45μg/mL）3μL，均滿足S/N=3，即D-果糖的檢測下限為50.30 ng、D-葡萄糖為116.7 ng、蔗糖為94.35 ng。

分別進樣D-果糖（25.15μg/m L）5μL、D-葡萄糖（38.90μg/mL）5μL、蔗糖對照品（31.45 μg/mL）5μL，均滿足S/N=10，即D-果糖的定量下限為125.8 ng、D-葡萄糖為194.5 ng、蔗糖為157.3 ng。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取生白術藥材（批號1408034）9份，3份一組，每份10 g，置于250 mL圓底燒瓶中，分別按相當于生白術藥材中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖80%、100%、120%的量精密加入對照品適量，按 “2.4”項下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣10μL分析，計算平均回收率。結果，D-果糖平均回收率為101.4%、D-葡萄糖為100.1%、蔗糖為102.0%，見表2。

表2 D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖的回收率（n=9）Tab.2 Recovery rates of D-fructose，D-gIucose and sucrose（n=9）

2.11 含有量測定 取10批生白術樣品適量，分

成3份，按 “2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分析，測定其中D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖的峰面積，外標兩點法分別計算其含有量（mg/g），結果見表3。

表3 不同批次生白術中D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖的含有量Tab.3 Contents of D-fructose，D-gIucose and sucrose in different batches of Atractylodesmacrocephala Koidz

表3 不同批次生白術中D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖的含有量Tab.3 Contents of D-fructose，D-gIucose and sucrose in different batches of Atractylodesmacrocephala Koidz

編號 產(chǎn)地 批號 含有量/（mg.g-1，按生藥計）D-果糖 D-1310167 45.83±0.320 6.312±0.020 10.22±0.039 1408034 13.35±0.200 1.445±0.009 9.496±0.141 2 浙江磐安縣大磐鎮(zhèn)林豐村 1405104 35.93±0.163 3.316±0.011 15.76±0.067 3 浙江磐安縣大磐鎮(zhèn)小磐村孔榮田 1404160 13.70±0.025 1.198±0.002 7.354±0.047 4 安徽省毫州市譙城區(qū)十九里鎮(zhèn) 1410012 11.26±0.015 1.414±0.010 6.893±0.005 5 湖北巴東縣綠蔥城鎮(zhèn) 1403148 9.946±0.139 1.239±0.003 6.048±0.021 6 安徽毫州 1410142 18.59±0.035 1.435±0.011 5.231±0.010 7 浙江新昌縣儒岙鎮(zhèn)南山村 1401041 12.67±0.046 1.539±0.008 9.367±0.021 8 湖南郴州 1308017 36.92±0.214 7.743±0.021 10.12±0.061 9 湖南廉橋 1311086 38.02±0.283 5.257±0.019 10.24±0.150 10 江西上高葡萄糖 蔗糖1 浙江磐安縣安文鎮(zhèn)崗頭村

3 討 論

3.1 定性研究

3.1.1 對照品定性法 本實驗分別進樣D-果糖（3.890 mg/mL）、D-葡萄糖（3.145 mg/mL）、蔗糖（0.725 mg/mL）、麥芽糖（1.905 mg/mL）、木糖（0.725 mg/m L）、甘露糖（0.480 mg/m L）、鼠李糖（0.278 mg/mL）和半乳糖（0.377 mg/mL）對照品及生白術樣品，通過比較保留時間，發(fā)現(xiàn)白術中存在D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖。

3.1.2 LC-MS定性法 UFLC-Q-TOF/MS法對白術水提液進行定性分析，Analyst TF 1.6軟件采集數(shù)據(jù)，Peak View軟件中的XIC Manager功能進行目標化合物的篩查和確證、Formula finder功能測得化合物的分子量，結合特征碎片，再根據(jù)UFLC-QTOF/MS總離子流圖中供試品與對照品保留時間的比較，最終確定白術水提液中存在D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖。UFLC-Q-TOF/MS總離子流圖見圖2，總離子流圖中化合物1～3的一級質(zhì)譜圖見圖3。

圖2 UFLC-Q-TOF/M S總離子流圖Fig.2 UFLC-Q-TOF/MS totaIion current chromatograms

圖3 UFLC-Q-TOF/MS總離子流圖中化合物1～3的一級質(zhì)譜圖Fig.3 First order mass spectra of com pounds 1-3 in UFLC-Q-TOF/MS totaI ion cu rrent chromatograms

接著，將簡單論述LC-MS法定性D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖的過程。

化合物1：保留時間為10.536 min的峰在ESI模式下，得到m/z 179的離子峰，由于D-果糖和D-葡萄糖的相對分子質(zhì)量均為180，故推測m/z

179.058 5為［M-H］-準分子離子峰。然后，F(xiàn)ormula finder軟件推測其可能分子式為C6H12O6，理論相對分子質(zhì)量為 179.056 1，實測值為179.058 5，誤差為13.3 ppm。UFLC-Q-TOF/MS總離子流圖中供試品與D-果糖對照品的保留時間一致，可判斷化合物1為D-果糖。

化合物2：保留時間為13.654 min的峰在ESI-模式下，得到m/z 179的離子峰，推測m/z 179.058 4為 ［M-H］-準分子離子峰，其可能分子式為C6H12O6，理論相對分子質(zhì)量為179.056 1，誤差為12.8 ppm。供試品與D-葡萄糖對照品的保留時間一致，可判斷化合物2為D-葡萄糖。

化合物3：保留時間在20.630 min時的峰在ESI模式下，給出m/z 341.110 3的離子峰 ［MH］-，得到m/z 179.058 3的［M-H-Glc］-碎片，F(xiàn)ormula finder軟件計算其可能分子式為C12H22O11，理論相對分子質(zhì)量為 341.108 9，實測值為341.110 3，誤差為4.0 ppm。UFLC-Q-TOF/MS總離子流圖中供試品與蔗糖對照品的保留時間一致，可判斷化合物3為蔗糖。

3.2 色譜條件的選擇 采用HPLC-ELSD法，本實驗考察了多個氨基鍵合硅膠色譜柱，發(fā)現(xiàn)氨基柱能較好地分離D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖等低分子糖，出峰時間合適，分離度好，檢測靈敏度較高?？紤]到最佳的分離效果，選用Waters XBridgeTMAmide色譜柱（4.6 mm×250 mm，3.5μm）。

另外，還考察了乙腈-水和甲醇-水這兩種流動相體系對白術藥材的檢測效果，并采用等度洗脫，考察了不同配比的流動相對白術藥材中D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖成分的分離情況。結果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水 （80：20）具有更好的分離效果，出峰多，基線穩(wěn)，各色譜峰均能較好地分離，而且保留時間適中，峰形理想，故選擇乙腈-水 （80：20）作為流動相。

3.3 提取條件的優(yōu)化 本實驗對提取方式 （回流、超聲、冷浸）、溶劑體積 （8、10、12倍量）、時間 （0.5、1、1.5 h）、次數(shù) （2、3次）和醇沉溶劑 （甲醇、乙醇）進行了考察，確定最優(yōu)提取條件為12倍量水回流提取2次，每次1.5 h，并用甲醇醇沉。

綜上所述，所建立的HPLC-ELSD法具有簡便、快速、準確的特點，可用于生白術中D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖的測定。結果發(fā)現(xiàn)，三者含有量依次為D-果糖＞蔗糖＞D-葡萄糖，而且不同批次生白術中其差異比較明顯，可為白術水提液的質(zhì)量研究奠定基礎。

［1］ 李家實.中藥鑒定［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1996：202.

［2］ 楊 娥，鐘艷梅，馮毅凡.白術化學成分和藥理作用的研究進展［J］.廣東藥學院學報，2012，28（2）：218-221.

［3］ 邱 琴，崔兆杰，劉延禮，等.白術揮發(fā)油化學成分的GC-MS研究［J］.中草藥，2002，33（11）：980-982.

［4］ 沈國慶，何法霖，李鳳新，等.白術揮發(fā)油化學成分及抗腫瘤實驗研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2009，32（6）：413-415.

［5］ Li CQ，He L C，Dong H Y，et al.Screening for the anti-inflammatory activity of fractions and compounds from Atractylodes macrocephala Koidz［J］.J Ethnopharmacol，2007，114（2）：212-217.

［6］ 黃寶山，孫建樞，陳仲良，等.白術內(nèi)酯Ⅳ的分離鑒定［J］.植物學報：英文版，1992，34（8）：614-617.

［7］ 林永成.中藥白術中一種新的雙倍半萜內(nèi)酯［J］.中山大學學報：自然科學版，1995，3（5）：27.

［8］ Ding H Y，Liu M Y，Chang W L，et al.New sesquiterpenoids from the rhizomes of Atractylodesmacrocephala［J］.Ghin Pharm J，2005，57（1）：37-42.

［9］ 陳建民，俞敏倩，沈銀柱，等.組織培養(yǎng)白術和天然白術化學成分的比較［J］.植物學報，1991，33（2）：164-167.

［10］ Chen Z L，Cao W Y，Zhou G X，et al.A sesquiterpene lactam from Artractylodes macrocephala［J］.Phytochemistry，1997，45（4）：765-767.

［11］ Kitajima J，Kamoshita A，Ishikawa T，et al.Glycosides of Atractylodes ovata［J］.Ghem Pharm Bull，2003，51（9）：1106-1108.

［12］ Han J H，Kim J，Kim S，et al.Anti-oxidative compounds from the aerial parts of Atractylodesmacrocephala Koidzumi［J］. Yakhak Hoeji，2007，51（2）：88-95.

［13］ 李 偉，文紅梅，崔小兵，等.白術的化學成分研究［J］.中草藥，2007，38（10）：1460-1462.

［14］ 池玉梅，李 偉，文紅梅，等.白術多糖的分離純化和化學結構研究［J］.中藥材，2001，24（9）：647-648.

Sim u Itaneous determ ination of D-fructose，D-g Iucose and sucrose in Atractylodes macrocephala Koidz.by HPLC-ELSD

SUN Xue， WU Shu-qing， WEN Hong-mei*， CUIXiao-bing， LIWei

（Nanjing University of Ghinese Medicine，Nanjing 210023，Ghina）

AIM To establish amethod for simultaneously determining D-fructose，D-glucose and sucrose in Atractylodesmacrocephala Koidz.by HPLC-ELSD and analyze these three constituents in different growing areas（Zhejiang，Anhui and Hubei Province）and batches of this plant.METHODS The analysis of Atractylodesmacrocephala Koidz.extractwas performed onWaters XBridgeTMamide column（4.6mm×250mm，3.5μm），mobile phase was acetonitrile-water（80：20），flow rate was1.0 mL/min，and column temperature wasmaintained at40℃.Time-of-flightmass spectrometer（TOF/MS）and electro-spray ion source（ESI）were used for qualitative analysis in a negative ion mode，and mass scan range was m/z 50-800.RESULTS Good linear relationships were in the ranges of7.943-18.53μg for D-fructose，0.583 5-1.362μg for D-glucose and 1.415-3.302μg for sucrose（r＞0.998）.Their average recoverieswere101.4%，100.1%and 102.0%with the RSDs of1.3%，1.8%and 1.3%，respectively（n=9）.In ten batches of Atractylode macrocephala Koidz.，the contents of D-fructose，D-glucose and sucrose were 9.946-45.83 mg/g，1.198-7.743 mg/g and 5.231-15.76 mg/g，respectively.CONCLUSION The contents are in the orderof D-fructose＞sucrose＞D-glucose in differentgrowing areas and batches of Atractylodesmacrocephala Koidz.，having obvious difference.

Atractylodesmacrocephala Koidz.；D-fructose；D-glucose；sucrose；HPLC-ELSD

R284.1

A

1001-1528（2015）11-2473-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.030

2015-02-04

江蘇省中藥學優(yōu)勢學科開放課題 （YS2012ZYX309）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目 （1014-2017）；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項 （201307008）

孫 學（1991—），女，碩士，研究方向為藥物分析。Tel：15861812711，E-mail：xuexue_2013726@163.com

*通信作者：文紅梅 （1965—），女，教授，博士生導師，研究方向為藥物分析與代謝。Tel：（025）85811839，E-mail：njwenhm@126.com