吳宇辰，張長勝，梁斐，黃丹，朱驥,5，徐燁，劉方奇

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2. 合肥市第二人民醫(yī)院胃腸外科，安徽 合肥 230011；

3. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院臨床統(tǒng)計中心，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

4. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

5. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

結(jié)直腸癌是我國第六大常見腫瘤，其致死率排名第五位［1］。相當一部分患者在診斷時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。對晚期結(jié)直腸癌患者，姑息手術(shù)，輔助放化療以及單抗藥物的應(yīng)用可有效改善患者生活質(zhì)量并延長生存［2］。因而，對化療反應(yīng)及預(yù)后的準確預(yù)測尤為重要。

DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)是結(jié)直腸癌發(fā)病的重要原因［3］。它是指用于修復(fù)DNA復(fù)制錯誤的錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS1和PMS2)發(fā)生突變導(dǎo)致的DNA高度重復(fù)序列(微衛(wèi)星)的增多，進而誘發(fā)腫瘤。它的機制包括：MLH1基因啟動子部位的甲基化以及錯配修復(fù)基因的遺傳突 變。前者主要見于15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌［4］，而后者是遺傳性非腺瘤性結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)的發(fā)病機制［5-6］。MSI狀態(tài)有多重檢測方法，其中免疫組化方法在診斷MSI狀態(tài)有著方便，快速，價格相對低等優(yōu)勢，是目前臨床醫(yī)學(xué)運用的主要方式。Lindor等［7］的研究證實此方法擁有良好的靈敏度(>90%)及特異度(100%)

微衛(wèi)星不穩(wěn)定在預(yù)測腸癌患者預(yù)后及化療反應(yīng)方面也有重要作用。相較微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability，MSS)的腸癌，MSI患者多以Ⅱ，Ⅲ期腸癌為主，同時具有更長的總體生存時間(overall survival，OS)［8-9］。早期研究發(fā)現(xiàn)，對于腫瘤可切除的非晚期腸癌患者，M S I 患者能夠從5-F U 為基礎(chǔ)的化療中獲益［10-11］。但之后Ribic等［12］通過隨機對照試驗否定了上述結(jié)論，同時越來越多的研究也否定該結(jié)果［13-15］。因而，Ⅱ，Ⅲ期MSI患者無法從以5-FU為基礎(chǔ)的化療中獲益已成共識。

由于MSI狀態(tài)在晚期結(jié)直腸癌患者中比例較低，因而針對此類患者，其生存預(yù)測作用及與化療敏感性的關(guān)系研究較少。Des Guetz等［16］的系統(tǒng)綜述在評估近年所有MSI與晚期腸癌的研究認為MSI患者與MSS患者在對化療的敏感性方面沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但由于該研究入組較少(6項)，且由于化療方案不盡相同故其相關(guān)結(jié)果仍頗具爭議。

為了解微衛(wèi)星狀態(tài)對Ⅳ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響以及對以奧沙利鉑聯(lián)合5-FU為基礎(chǔ)的一線化療方案的敏感性，本研究回顧性分析此類患者的臨床特征及預(yù)后，以期為晚期結(jié)直腸癌患者化療指導(dǎo)及預(yù)后評估提供參考。

1 資料和方法

1.1 研究對象

入選條件：2008年3月—2012年3月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的同時性或異時性Ⅳ期散發(fā)性結(jié)直腸癌患者；腸鏡證實為結(jié)腸直腸癌；部分同時性Ⅳ期患者接受原發(fā)灶切除手術(shù)；經(jīng)PET-CT、ECT、CT 和MR 影像學(xué)檢查(一項或多項)證實有遠處轉(zhuǎn)移灶且轉(zhuǎn)移灶均未接受手術(shù)或其他局部治療；均接受以奧沙利鉑聯(lián)合5-FU為基礎(chǔ)的一線化療方案；有足夠的組織標本行MMR蛋白表達檢測評判微衛(wèi)星狀態(tài)。

1.2 姑息化療方法

FOLFOX：奧沙利鉑135 mg/m2，靜脈滴注；第1天，亞葉酸鈣 200 mg/m2；5-FU 400 mg/m2，推注2 h，后續(xù)600 mg/m2，靜脈持續(xù)滴注48 h，第1～14天為1個周期。 XELOX：卡培他濱 1 000 mg/m2，口服，2次/日，第1～14天；奧沙利鉑135 mg/m2，靜脈滴注，第1～21天為1個周期?；熀?、6個月，及化療終止時進行評估，評估采用胸部，腹部及盆腔CT、MRI或PET/CT等影像學(xué)檢查。后續(xù)二線治療包括FOLFIRI方案(亞葉酸鈣、5-FU及伊立替康聯(lián)合)，靶向藥物(貝伐單抗或西妥昔單抗)等。

1.3 化療反應(yīng)性的評定標準

采用WHO實體腫瘤評價標準分為完全緩解(complete response，CR)，部分緩解(partial response，PR)，穩(wěn)定(stable disease，SD)，進展(progressive disease，PD)，CR+PR為有效率，CR+PR+SD為疾病控制率。根據(jù)患者住院病史記錄，登記其基本特征、疾病原發(fā)時間、腫瘤病理特征。后采用電話或門診隨訪，末次隨訪時間為2015年2月。OS定義為從診斷為Ⅳ期腸癌至死亡或末次隨訪時間。在同時性Ⅳ期結(jié)直腸癌患者且行原發(fā)灶姑息切除手術(shù)患者中，無進展生存期(progression free survival，PFS)指從術(shù)后開始到患者出現(xiàn)腫瘤進展的時間。

1.4 微衛(wèi)星不穩(wěn)定分析

該研究采用免疫組化法檢測腫瘤組織中錯配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達。任何一項錯配修復(fù)及因表達缺失，被定義為“微衛(wèi)星不穩(wěn)”。

術(shù)后腸癌組織固定，包埋，并制成石蠟切片。經(jīng)烤片，脫蠟后，PBS清洗3次，每次3 min。切片經(jīng)30%過氧化氫-甲醇混合液浸泡10 min后，放入加有檸檬酸鈉的染缸，煮沸10 min，自然恢復(fù)至室溫。PBS洗滌后將兔抗人MLH1、MSH2、MSH6及PMS2(Abcam，Cambridge，MA；USA)按1∶300稀釋，50 μL滴至切片的組織上，將切片放于濕盒中，4 ℃過夜。后室溫平衡30 min，用PBS緩沖液，洗滌3次，每次10 min，二抗于組織上，放于濕盒中，室溫溫育30 min。鏈霉素卵白素辣根過氧化物酶及DAB個30 min染色，水洗、吹干、樹脂封片。鏡檢，若腫瘤組織陰性表達而正常黏膜陽性表達，表示有缺失，提示突變。MLH1、MSH2、MSH6或PMS2中任何一個基因蛋白的表達缺失，即認為MSI腫瘤，否則即為MSS。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。對兩組數(shù)據(jù)基線資料及年齡行獨立樣本t檢驗，對性別、病理、化療方案、分化程度、腫瘤部位、是否有遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等采用χ2檢驗或者Fisher精確檢驗。Log-rank檢驗來比較兩組患者之間PFS和OS之間的差異。采用Cox回歸模型探索患者預(yù)后的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與基本臨床特征

共收集符合入選條件患者113例。其中同時性遠處轉(zhuǎn)移患者93例，既往原發(fā)灶切除的異時性遠處轉(zhuǎn)移患者20例。全部患者中MSI患者35例，MSS患者78例。

由于異時性遠處轉(zhuǎn)移患者人數(shù)相對較少，且存在既往腫瘤分期及治療方案不同等不均一因素，為有效控制變量，我們進一步分組，篩選其中同時性遠處轉(zhuǎn)移且原發(fā)灶姑息性手術(shù)治療的患者共79例，其中MSI患者22例，MSS患者57例。兩組間各基本臨床特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)對患者預(yù)后的影響

根據(jù)微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)將患者分為MSI組和MSS組，在樣本中(113例)，兩組OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.607，圖1)。通過進一步分組后，在79例同時性遠處轉(zhuǎn)移且原發(fā)灶姑息性切除的患者中，MSI患者的PFS顯著優(yōu)于MSS患者(P=0.005，圖2A)。同時，MSI患者的OS顯示優(yōu)于MSS患者的趨勢(P=0.07，圖2B)。

2.3 同時性遠處轉(zhuǎn)移且原發(fā)灶姑息性切除患者預(yù)后多因素分析

基于上述結(jié)果，我們進一步將79例同時性遠處轉(zhuǎn)移且原發(fā)灶姑息性切除患者依據(jù)MSI狀態(tài)、年齡、性別、病理及分化程度、腫瘤原發(fā)部位及轉(zhuǎn)移部位分別納入Cox多因素回歸模型(表2)。

圖1 113例患者MSI及MSS的總體生存曲線Fig. 1 Kaplan-Meier curves for overall survival of 113 patients with metastatic colorectal cancer stratifi ed by microsatellite status

在Cox模型中，腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)(P=0.043)，腫瘤分化程度(P=0.021)，右半結(jié)腸腫瘤(P=0.016)及遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.047)是此組患者PFS的獨立預(yù)后因子。而在OS組中，沒有發(fā)現(xiàn)具有獨立預(yù)測作用的因子。

表1 79例同期遠處轉(zhuǎn)移且行姑息性手術(shù)患者臨床特征比較Tab. 1 Clinical characteristics of 79 patients with synchronous metastatic colorectal cancer and palliative tumor resection

2.4 化療療效

所有患者均可評價療效。無一例患者出現(xiàn)CR。113例患者中(表3)，MSI組化療總有效率(PR)11.4%，疾病控制率(PR+SD)51.4%；MSS組總有效率7.7%，疾病控制率41.0%。兩組總有效率(P=0.562)及疾病控制率(P=0.303)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 79例患者MSI及MSS的生存曲線Fig. 2 Kaplan-Meier curves for survival of 79 patients with synchronous metastatic colorectal cancer and palliative tumor resection stratifi ed by microsatellite status

表2 多因素分析Tab. 2 Cox multivariate analysis

在同時性遠處轉(zhuǎn)移且原發(fā)灶姑息性切除的79例患者中(表4)，MSI組PR 2例，SD 11例，PD 9例，總有效率9.1%，疾病控制率59.1%；MSS組PR 3例，SD 15例，PD 39例，總有效率5.3%，疾病控制率31.6%。在比較兩組化療反應(yīng)時，我們發(fā)現(xiàn)MSI 組的化療總反應(yīng)率好于MSS組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.08)。MSI組的疾病控制率高于MSS組。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025)。

表3 113例患者化療反應(yīng)比較Tab. 3 Treatment response in correlation to MSI status of 113 patients

表4 79例初治及姑息手術(shù)患者化療反應(yīng)比較Tab. 4 Treatment response in correlation to MSI status of 79 patients

3 討 論

以往研究中微衛(wèi)星不穩(wěn)的晚期腸癌患者的中位生存時間存在較大差異，且微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)對患者預(yù)后的影響仍存在爭議。Des Guetz等［16］的Meta分析總結(jié)認為MSI患者中位生存時間為9～33個月，且MSI對晚期腸癌患者總生存時間及化療反應(yīng)無影響。本研究全部113例晚期結(jié)直腸癌患者，其中位生存時間為23.5個月，其中MSI患者中位生存時間為24.5個月。MSI患者化療反應(yīng)相對于MSS患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果與上述研究基本相符。但是，上述報道未分類研究外科治療和化療具體方案方案，并且未嚴格控制患者納入標準，因而缺乏一定準確性。

為此，我們進一步優(yōu)化入組標準，選擇其中病程及治療可控，且人數(shù)最多的組，即同期遠處轉(zhuǎn)移且原發(fā)灶姑息手術(shù)治療的患者組，進行進一步分析。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然此組中MSI患者與MSS患者的OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但MSI患者中位無進展生存期為19.9個月，而MSS患者中位無進展生存期僅7個月。PFS差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。此外，在多因素分析中，MSI仍可作為PFS的獨立預(yù)測指標。由此可見，同期遠處轉(zhuǎn)移且采用姑息手術(shù)治療的患者中MSI者有更好的PFS，如此巨大的差異在以往的研究中未見報道。

在針對5-FU為基準的化療中，有關(guān)MSI晚期腸癌是否有更好化療反應(yīng)一直存在爭議。Liang等［17］發(fā)現(xiàn)對使用高劑量5-FU聯(lián)合亞葉酸鈣(5-FU：2 600 mg/m2；亞葉酸鈣：300 mg/m2)后，MSI患者有著更好的化療反應(yīng)率(65.7% vs 35.1%，P=0.001)和總體生存時間(24個月 vs 13個月，P=0.000 1)。同時，這一結(jié)果也被Brueckl等［18］證實。但在，以奧沙利鉑聯(lián)合5-FU作為一線化療藥物的其他研究中，MSI患者并未取得更好的化療反應(yīng)。Des Guetz等［19］首次報道了MSI對基于FOLFOX化療的44例(其中MSI 9例)晚期結(jié)直腸癌患者的治療作用，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)MSI患者的化療反應(yīng)及預(yù)后與MSS組的區(qū)別。另外，Müller等［20］也比較了MSI對采用FOLFOX或XELOX為一線化療的晚期結(jié)直腸癌中的影響(其中MSI 4例)，并在分析化療反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，MSS的患者其疾病控制率(CR+PR+SD)明顯優(yōu)于MSI組(P=0.019)，且MSI對PFS和OS依舊沒有預(yù)測作用。但不容忽視的是，由于MSI在晚期結(jié)直腸癌中發(fā)生率很低［21］，這兩項研究普遍存在MSI患者過少的問題，也未對患者的手術(shù)治療方式等因素進行分組討論，因而有一定的偏倚。本研究中，我們納入更多MSI患者，并首次對同時性遠處轉(zhuǎn)移且原發(fā)灶姑息性切除并使用奧沙利鉑聯(lián)合5-FU作為一線化療方案的患者的MSI狀態(tài)進行討論，不僅發(fā)現(xiàn)了MSI可作為獨立預(yù)測患者PFS的影響因子，還發(fā)現(xiàn)了MSI患者有著更好的疾病控制率。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)對于同時性遠處轉(zhuǎn)移且原發(fā)灶姑息性切除的這一類患者，在基于奧沙利鉑聯(lián)合5-FU為基礎(chǔ)的化療中，MSI患者比MSS患者擁有更好的PFS及疾病控制率，且MSI可以作為獨立的預(yù)測PFS因素。

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