毛英，陳保華，李新建，姚斌

鷹潭市解放軍第一八四醫(yī)院普外科，江西 鷹潭 335000

微小RNA分子(miRNA)是一種內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，廣泛分布于動(dòng)植物細(xì)胞體內(nèi)，大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA在惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中包括調(diào)控細(xì)胞的增 殖、分化和凋亡［1-2］。近年研究報(bào)道m(xù)iR-224在肝細(xì)胞 癌、腸癌等惡性腫瘤中呈過(guò)表達(dá)且與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3-5］。然而miR-224表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖與凋亡的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中我們采用TagMan MGB探針?lè)z測(cè)miR-224在Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)情況，同時(shí)利用反義寡核酸技術(shù)(antisense oligonucleotide，ASO)抑制miR-224在Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)，分析miR-224對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料 和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

Hep3B細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Bal B/C裸鼠，4～5周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于SPF無(wú)菌環(huán)境下。

1.1.2 主要試劑和儀器

TaqMan miRNA分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反義miR-224寡核苷酸(miR-224 ASO)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，總蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)santa cruz公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司, 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-224的表達(dá)

采用TRIzol試劑提取Hep3B細(xì)胞miR-224 ASO轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組織中總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，-80 ℃保存，運(yùn)用miR-224檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-224的表達(dá)。首先取2 μg總RNA為反應(yīng)模板與3 μL反轉(zhuǎn)錄酶相互混合，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，收集cDNA，將其稀釋150倍，然后取1 μL稀釋的cDNA與2 μL TaqMan引物相混合，20 μL反應(yīng)體系：95 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 15 s，59 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。相對(duì)miRNA表達(dá)采用ct值精確計(jì)算，將U6 snRNA作為內(nèi)參。

1.2.2 反義miR-224單核苷酸序列設(shè)計(jì)

MiRBase(http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna)提供的miRNA基因序列，獲取人miR-224的序列，并設(shè)計(jì)其反義寡核苷酸序列，同時(shí)運(yùn)用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序以排除其他的同源序列。另外，我們同時(shí)設(shè)計(jì)一條隨機(jī)對(duì)照序列，miR-224順義鏈：5’-AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA-3’，反義鏈：5’-TAAACGGAACCACTAGTGACT- 3’；隨機(jī)序列順義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU TT-3’，反義鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3’， 送Invitrogen公司合成，PAGE純化，全硫代修飾。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染

將Hep3B細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。嚴(yán)格遵照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作程序進(jìn)行轉(zhuǎn)染，反義miR-224寡核苷酸終濃度分別為50、100、150和200 nmol/L，我們前期初步篩選出最佳終干擾濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48和72 h，初步篩出最佳作用時(shí)間為48 h。將熒光對(duì)照的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后置于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，上述操作重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染效率為(88.5±6.4)%。

1.2.4 轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后對(duì)miR-224表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染miR-224 ASO與對(duì)照ASO 48 h后，提取總RNA， 測(cè)定濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(反應(yīng)條件同1.2.1)，測(cè)定cDNA濃度。運(yùn)用miR-224檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-224的表達(dá)(具體條件同1.2.1)。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hep3B細(xì)胞的增殖

Hep3B細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含3%胰蛋白酶消化細(xì)胞。接種于6孔培養(yǎng)板中，大約500～600個(gè)細(xì)胞/孔，置37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，飽和濕度的條件下，培養(yǎng)2～3周。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆細(xì)胞團(tuán)時(shí)，終止培養(yǎng)。移去上清液，運(yùn)用PBS漂洗2次。加甲醇固定20 min，去除固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染30 min，用ddH2O清洗染色液，經(jīng)干燥后在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 MTT檢測(cè)Hep3B細(xì)胞增殖情況

收集H e p 3 B 細(xì)胞，將各組細(xì)胞懸液在離心管內(nèi)反復(fù)充分打勻，接種于9 6 孔培養(yǎng)板(6×103/孔)，24 h后換液。實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4，每組設(shè)有6個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后1～4 d每孔加入MTT試劑(濃度為5 mg/mL)20μL，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下繼續(xù)溫育4 h。用移液器吸取各孔上清液，加入DMSO 150 μL/孔，在室溫條件下?lián)u10 min(置水平搖床)以充分完全溶解MTT結(jié)晶。測(cè)定各孔吸光度(D490nm)值。每組重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(D490nm實(shí)驗(yàn)組平均-D490nm對(duì)照組平均)÷D490nm對(duì)照組平均×100%。

1.2.7 活體內(nèi)檢測(cè)miR-224 ASO對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的影響

將18只(4～5周齡)裸鼠(購(gòu)自上海斯萊克公司)飼養(yǎng)于SPF無(wú)菌環(huán)境下。Hep3B細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照ASO或miR-224 ASO后，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞(約2×106個(gè))制成150 μL細(xì)胞懸液，運(yùn)用微量注射器接種于裸鼠左側(cè)大腿背部皮下。成瘤后定期測(cè)量腫瘤的大小，并運(yùn)用公式(V=D×d2×π/6)(D，d分別代表腫瘤的最大直徑和最小直徑)計(jì)算腫瘤的體積［6］，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。飼養(yǎng)6周后處死裸鼠，取瘤稱重。經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色后，在光鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)特征。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞早期凋亡

實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4，將細(xì)胞接種于6孔板中， 轉(zhuǎn)染反義miR-224寡核苷酸。經(jīng)48 h后收集細(xì)胞并制備為單細(xì)胞懸液，采用PBS漂洗2次，離心、棄上清液。最后運(yùn)用Annexin V-FITC早期凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的早期凋亡情況。

1.2.9 檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平

各組培養(yǎng)細(xì)胞加入TRIzol裂解液，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用SYBR Green Real Time PCR Master Mix通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè)Bcl-2 mRNA的表達(dá)。Bcl-2基因的引物序列為上游： 5’-AACTGGGGGAGGATTGTGGC-3’；下游：5’-GATCCAGGTGTGCAGGTGCC-3’。反應(yīng)條件：95 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參。在ABI7500反應(yīng)平臺(tái)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.10 檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染miR-224 ASO的Hep3B細(xì)胞，運(yùn)用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，經(jīng)10%SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，將膜放在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中37 ℃封閉2 h，加一抗稀釋液 1∶500稀釋鼠抗人Bcl-2單克隆抗體在4 ℃溫育過(guò)夜，1×TBST緩沖液洗膜10 min×3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，置于37 ℃溫育2 h，1×BST緩沖液洗膜10 min×3次，運(yùn)用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(±s )表示，兩組間均數(shù)的比較采用Student’s t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hep3B細(xì)胞miR-224的表達(dá)情況

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-224 ASO轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-224 ASO轉(zhuǎn)染組miR-224的表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

2.2 降低miR-224的表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞存活率的影響

轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-224的表達(dá)較對(duì)照明顯降低(P<0.05，圖2A)。同時(shí)MTT檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后組細(xì)胞生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。

2.3 降低miR-224的表達(dá)對(duì)體外Hep3B細(xì)胞增殖的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：miR-224ASO轉(zhuǎn)染后，Hep3B細(xì)胞克隆形成率較對(duì)照明顯降低(P<0.05，圖3)。

2.4 降低miR-224的表達(dá)對(duì)活體腫瘤增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)所有的裸鼠腫瘤成瘤率為100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224 ASO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組的腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.5 降低miR-224的表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響

Hep3B轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示：Hep3B細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，凋亡增加明顯，而對(duì)照ASO轉(zhuǎn)染后凋亡無(wú)明顯變化(P<0.05，圖5)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-224 的表達(dá)Fig. 1 miR-224 mRNA expression detecting by qRT-PCR

圖2 轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，Hep3B細(xì)胞miR-224的表達(dá)和生長(zhǎng)情況變化Fig. 2 Hep3B cells proliferation (A) and expression mRNA level (B) miR-224 of after transfection

圖3 轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，Hep3B細(xì)胞克隆形成率明顯降低Fig. 3 Colony formation rate of Hep3B cells after transfection

圖4 活體內(nèi)miR-224ASO轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞致瘤的體積變化Fig. 4 The volume of nude mice tumors after transfection

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-224 ASO轉(zhuǎn)染后的Hep3B細(xì)胞凋亡情況Fig. 5 Hep3B cells apoptosis after transfection detecting by MTT

2.6 降低miR-224的表達(dá)對(duì)Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

miR-224 ASO轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞后，利用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224 ASO組Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照ASO轉(zhuǎn)染組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

圖6 Bcl-2 mRNA和蛋白在轉(zhuǎn)染miR-224 ASO 的Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig. 6 Bcl-2 expression at protein level and mRNA level after transfection

3 討 論

miRNAs是一類新的調(diào)控因子，在控制細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化、血管形成和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用［7-8］。miRNA通過(guò)與靶mRNA的3’非編碼區(qū)近乎完全互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解, 或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。隨著越來(lái)越多的miRNA被鑒定和深入研究，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與惡性腫瘤關(guān)系密切，大約有調(diào)控miRNAs編碼基因位的52%位于腫瘤相關(guān)染色體區(qū)域［9-10］。有研究者認(rèn)為miRNA 實(shí)際上可作為癌基因或者抑癌基因而發(fā)揮作用。因此，miRNAs可能成為診斷腫瘤新的分子標(biāo)志和判斷腫瘤治療及預(yù)后的分子靶點(diǎn)，且miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，更有助于惡性腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，其必將具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［11］。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，侵襲轉(zhuǎn)移快，死亡率很高。肝細(xì)胞癌早期癥狀不典型，肝移植效果好，肝臟來(lái)源有限，費(fèi)用高。手術(shù)并不能最終解決肝癌侵襲轉(zhuǎn)移性問(wèn)題。因此，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌的早期診療標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。近年隨著miRNAs研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)包括miR-122、miR-21、miR-224等在內(nèi)的多個(gè)MicroRNA的異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，多個(gè)MicroRNA參與了肝癌的增殖、分化、凋亡和死亡等一系列過(guò)程［12］。Li等［13］發(fā)現(xiàn)miR-224在肝癌細(xì)胞HepG2中表達(dá)上調(diào)且參與細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。最近Ding等［14］研究發(fā)現(xiàn)miR-224通過(guò)HOXD10影響肝癌細(xì)胞Hep3B細(xì)胞遷移，但miR-224對(duì)肝癌Hep3B細(xì)胞增殖、凋亡的作用尚不清楚。

我們首先利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-224 ASO與對(duì)照組Hep3B miRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224在轉(zhuǎn)染組中受到明顯抑制，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明miR-224在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。目前有大量研究針對(duì)目的miRNA設(shè)計(jì)相應(yīng)的ASO來(lái)研究miRNA在細(xì)胞中的生物學(xué)功能［16-17］。為了進(jìn)一步分析miR-224對(duì)Hep3B細(xì)胞功能的影響，我們首先通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-224 ASO降低Hep3B細(xì)胞中miR-224的表達(dá)，同時(shí)利用MTT方法檢測(cè)降低miR-224的表達(dá)后Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-224 ASO的Hep3B細(xì)胞存活率明顯降低。此外，我們運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)還觀察到轉(zhuǎn)染miR-224 ASO后，Hep3B細(xì)胞克隆形成率比對(duì)照ASO組明顯減少。同時(shí)我們?cè)诨铙w內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-224 ASO組Hep3B細(xì)胞皮下形成腫瘤的體積減小較對(duì)照ASO組顯著。這都表明miR-224在骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中起著非常重要的作用。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-224 ASO組Bcl-2 mRNA和蛋白水平明顯下降。這表明miR-224可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)而影響細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的調(diào)控。

綜上所述，miR-224在調(diào)控Hep3B的增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用，其很可能成為一個(gè)肝細(xì)胞癌新的癌前標(biāo)志物，為肝細(xì)胞癌臨床基因治療提供新的靶點(diǎn)。

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